原位分子杂交技术在电镜水平的应用

第二节　原位分子杂交技术在电镜水平的应用

　　自Gall和Pardue建立了原位杂交技术以来近20余年内，这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病毒学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料，发挥了其它技术难以取代的作用。近年来，此一技术的应用领域逐渐扩大并在两个主要进行了技术法的改进。一方面是应用一系列放大手段增强检测的灵敏度（详见二十二章　），另一方面是提高其分辨率，即向电镜水平发展。Jacob（1971）首先用 3 H标记的核酸RNA探针与DNA杂交并在电镜水平显示获得成功，继后不少科技工作者在这方面做了大量的工作（Manning et al 1975,Steinert et al 1976,Hutchison et al 1982）。但所应用的均是同位素标记核酸探针，直到1986年Binder首先用生物素标记的rDNA及UI探针，在蜂蝇（Drosophila）卵巢，应用Lowicryl-K4M低温包埋的切片上进行原位分子杂交，以蛋白A和胶体金复合物作为显示系统，较好的保存了组织的形态学结构和较高的信噪比例。Webster等人（1986）应用生物素标记探针显示了细胞内mRNA的分布。Singer等（1989）成功的用双标记原位杂交技术，一方面检测整装抽提细胞内与骨架结合的mRNA，同时显示了该mRNA所表达的蛋白质。新近Fischer等利用地高辛标记rRNA探针在Lowicryl-K4M包埋的切片进行杂交，然后以抗地高辛等抗体结合胶体金颗粒进行显示，以银显示法加强获得极为满意的定位。总之，电镜水平的原位分子杂交技术在国外还处在不断提高和改进的阶段，在国内此一技术还刚起步。焦仁杰等（1992）报告了以生物素标记腺病毒的 基因组 探针与整装抽提的细胞进行电镜原位杂交技术，成功地证明了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系，胶体金颗粒呈簇状与串珠状结合在核骨架上。向正华等（1994）应用地高辛标记探针结合HRP的包埋前染色法显示了POMc mRNA定位于神经元的粗面内质网上。下面列举几种代表性的电镜原位杂交技术。

一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片（Hutchison et al, 1982）

（1）将整封染色体铺片放置于金网上，在70%的酒精蒸汽固定4～15h，空气干燥。

（2）以强碱使DNA变性，将金网置于2×SSC内（应用0.1n NaOH调整至pH12），室温，2min。

（3）脱水，以70%和95%酒精各冲洗3次，空气干燥。

（4）杂交，金网覆于平面玻璃皿（ Petri dish）内的杂交液滴上，每滴约10～15μl，将此小碟置于盛于杂交缓冲的大塑料盒内，保持湿润，在60～65℃孵育4～24h。

　　杂交液的配制：6×SSC或6×TNS（1×TNs =0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000～50000cpm/10μl 3 h cRNA）。

（5）杂交后冲洗，金网自杂交液中取出后立即用大量的2×SSC冲洗多次。RNA酶溶液（20μg/ml）室温冲洗，然后再用2×SSC室温冲洗，冲洗后梯度酒精脱水（70%，95%）空气干燥。

（6）浸入乳胶膜，应用L-4核乳胶液，水稀释4倍。浸膜后的金网，用胶带固定在载玻片上放在密封的黑色塑料盒内，4℃，时间根据同位素种类和靶mRNA含量而定，也可选择不同时间曝光，根据显影强弱确定最终显影的时间。

（7）显影。暗盒自冷房或冰箱中取出后，在室渐中回暖至少30min，以防核乳胶膜皱缩。然后在显影液（Kodax Microdol X）显影3～5min，温度18～24℃。水冲，在15% Kodax快速定影液定影5min，然后在空气中干燥。

所有溶液应尽可能新鲜配制。

（8）电镜观察。

二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术

（一）基本原理

　　应用DNA探针缺口翻译（nick translation）方法，通过碱基配对以一条DNA链为模板，将生物素标记的某一种脱氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP渗入有缺口的DNA链。将生物素标记的DNA探针与细胞或组织进行原位杂交。显示方法有二种：一种是用HRP显示，类似免疫电镜技术中采取的包埋前染色法，利用地高辛-过氧化物酶HRP显色法进行光镜水平的厚片原位杂交免疫细胞化学染色，其步骤与第二十章　叙述的原位杂交免疫细胞化学基本方法相同，只是为了减少细胞微细结构的损伤，在包埋过程中减少H 2 O 2 和Triton X-10等易损伤细胞与组织结构的 试剂 用量（向正华等1993）。在显色完毕后，取反应阳性部位按常规电镜操作程序进行锇酸后固定，脱水，包埋，切片和观察。此法利用HRP免疫反应产物具有极高电子反应密度体积大小不一，加之非特异性反应产物常掩盖微细结构的背景，不易达到准确的定位。现在比较广泛应用的是生物素-蛋白A（PA）胶体金（gold）标记技术。用于原位杂交的电镜定位，取得较为满意的效果。其基本原理是利用生物素标记探针与细胞或组织进行原位杂交后，利用抗生物素抗体-结合蛋白A-金标记杂交体的超微结构定位，类似免疫电镜中的包埋后染色。在包埋剂应用方面，有报告应用环氧树脂包埋获得成功的。但大多数较满意的结果均获自低温亲水性包埋剂――Lowicryl-K4M，也有应用LR-white作为包埋剂的（详见第七章　）。

（二）应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术（Binder et al,1986）

1．固定　　现认为应用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸缓冲液中（pH7.4），为较理想的固定剂，也有主张单纯用4%多聚甲醛的，因经实验证明如应用高浓度4%的戊二醛比用多聚甲醛样品其杂交率减低60%。但作者认为应用少量戊二醛可较好的保持细胞的微细结构。也有报告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定时间在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS，在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸缓冲液中储存过夜。

2．脱水　　次日，用0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）冲洗30min，然后进行脱水，①65%乙二醇，0℃，60min；②80%乙醇-35℃，120min；③100%K4M：80%乙醇 =1：1，-35℃，120min；④100%K4M：80%乙醇=2：1，-35℃，60min；⑤100%K4M -35℃，过夜。

3．包埋　按照Roth et al（1981），组织块包埋于盛有K4M的胶囊中，在-35℃紫外线灯（波长360nm）照射聚合24～48h。取出后置室温，用紫外线灯继续照射24h，使变硬易于进行超薄切片。胶囊短期可保存于室温，如需长期保存，宜置于-70℃冰箱中，可保存近1年。

K4M配制（中等硬度）

交联接剂（cross-linker）　　2.7mg

单体（monomer）　　　　　　17.3mg

引发剂（initiator）　　　　0.10mg

可根据硬度需要调整各化合物比例。增加交联剂的量，组织块的硬度增加。

4．切片超薄切片50～60nm，捞于有覆有Formavar和碳膜的镍网上。

5．组织前处理和预杂交用含0.2mol/l Tris缓冲液的0.1mol/L甘氨酸（Ph7.4）冲洗15min，以除去醛类固定剂对杂交和检测的影响，然后2×SSC冲洗15min，再用变性液（70%去离子甲酰胺，2×SSC）在65℃处理样品5～10min，以达到变性的目的。变化后的样品在预杂交液中（50%去离子甲酰胺，0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,pH7.5）37℃预处理15min。

6．杂交镍网载有切片面覆盖于杂交液滴（约20μl）上，置于湿盒内37℃，1～2h。杂交液成份与光镜原位杂交免疫细胞化学相同（详见第二十章　），如为DNA探针须在沸水中先煮2～3min，以使之变性，然后迅速移至冰浴。

整个杂交过程须注意防止镍网上的杂交液干掉。

7．杂交后漂洗

含50%甲酰胺的2×SSC液　　37℃　　30min

含50%甲酰胺的1×SSC液室温30min

无甲酰胺的1×SSC液室温20min

样品置1×SSc 　　　　　　　4℃过夜

0.01mol/L PBS(pH7.2) 室温　　10min

4%BSA　　 封闭　　 15min

　　8．羊抗生物素IgG抗体（sigma）1：100（稀释用PBS液：2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH 2 PO 4 , 0.278% Na 2 HPO 4 ,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100）室温反应2h。

9．含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。

10．兔抗羊IgG的IgG相连10nm胶体金（Sigma