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质粒DNA的提取及电泳分析

2024-10-12 DNA 加入收藏
实验目的1.掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理和方法。2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA方法。3.熟悉质粒DNA提取与真核细胞核DNA提取的异同点。实验原理

实验目的

1.掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理和方法。

2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA方法。

3.熟悉质粒DNA提取与真核细胞核DNA提取的异同点。

实验原理

在pH值为12.0~12.6的碱性环境中,在去垢剂SDS的作用下,细菌的细胞壁与细胞膜均破裂,释放出大量的染色体DNA、RNA及质粒DNA。此时,所有双链DNA解聚成单链,但质粒DNA仍保持环状。当pH值恢复到中性时,在高盐浓度下,大分子量的染色体DNA只是部分复性,相互交织成不溶性的网状结构,与细胞碎片、部分蛋白质和大分子量的RNA一起沉淀,并可通过离心除去。而环状的质粒DNA可以完全复性,溶解于上清中,从而达到初步分离的目的。

采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过漂洗液将杂质和其他细菌成分去除,最后以低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

操作步骤

1.取1.5ml过夜培养的菌液,12000 rpm,离心30s,弃上清,尽可能倒干,收集菌体沉淀。

2.用100μl 溶液I(50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)重悬菌体沉淀,Tip吹打至彻底悬浮。

3.加入150μl 溶液II(0.2mol/L NaOH, 1% SDS),轻轻颠倒混匀4~6次,使充分菌体充分裂解,室温放置5 min,直至溶液变得清亮。

4.加入150μl 溶液III(4mol/L 盐酸胍,0.5mol/L KAc pH4.2),立即温和颠倒混匀4~6次。室温放置5 min,12000 rpm离心10 min,小心吸取上清。

5.加入400μl 结合缓冲液(5mol/L 盐酸胍,20mmol/L Tris-HCl pH6.6, 37.5%乙醇)于离心吸附柱中,然后将步骤4中的上清加入吸附柱中(不要将沉淀移入吸附柱),混匀,套入收集管中,12000 rpm离心30 s,倒掉收集管中的废液。

6.加入750μl 漂洗液(20mmol/L NaCl, 2mmol/L Tris-HCl pH7.5, 80%乙醇)于离心吸附柱中,静置1min ,12000 rpm离心15 s,倒掉收集管中废液。

7.重复步骤6一次。

8.再次于12000 rpm空离心2 min,尽量除去漂洗缓冲液中的乙醇。

9.取出离心吸附柱,将其套入一个干净的1.5ml Eppendorf管中,在硅基质膜中央部位加入50μl洗脱缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA pH8.0),室温放置2 min,12000 rpm离心1 min。

10.丢弃离心吸附柱,溶液中含有目的质粒DNA,置于4℃或-20℃保存。

注意事项

1. 所用器具必须严格清洗,最后要用双蒸水冲洗3次,凡可以进行灭菌的试剂与器具都要经过高压蒸汽灭菌,防止外源性核酸酶对DNA的降解以及其他杂质的污染。

2. 细菌培养容器最好用三角烧瓶,其容量至少应为培养液体积的四倍,从而保证氧气的供应。细菌培养不要超过16 h,否则细菌会崩解,引起细菌大量死亡,导致质粒丢失。

3. 溶液I在用前加入RNase A,并置于4℃保存。

4. 在碱裂解提质粒的方法中,关键之一是加入溶液III的时机,这决定了DNA变性与复性的时间。既要使溶液II 与染色体DNA充分作用使之变性,又要保证质粒DNA不会因作用时间过久而发生不可逆的变性。若质粒变性过度,将引起提取效率下降、内切酶切割困难等一系列问题。因此,加入溶液II切忌剧烈振荡,时间不应超过5 mins。

5. 加溶液溶液III离心后,倘若上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

6. 本试剂盒优点:快速、方便;产量高、纯度好;毒性低:采用硅基质膜离心柱纯化质粒DNA,不需酚、氯仿抽提


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