Northern blot实验技术

一、经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳

这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。

1、 在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：

6mol/L乙二醛 5.4μl

DMSO 16.0μl

0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl

RNA（多达10μl） 5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠（pH7.0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3。 0μg poly(A)+RNA。

2、 将微量离心管盖严，将RNA溶液置于50℃温育60分钟后， 用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。

3、 于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品， 而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。 用0mmol/L 磷酸钠（pH7.0 ）后， 降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H2 O2 ，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。

4、 将RNA样品冷却至0℃，加入4μl 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛－DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用 18S和28S rRNA或或9S兔β－珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基。也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。

乙二醛－DMSO凝胶加样缓冲液

50％甘油

10mmol/L磷酸钠（pH7.0）

0.25％溴酚蓝

0.25％二甲苯青FF

5、 将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中，以3－4V/cm电压降进行电泳，同时按图7。1对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液pH值维持在可被接受的限度 内（pH>8.0时乙二醛将从PNA分子上解离）。另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。

6、 电泳结束后（溴酚蓝迁移出区8cm），切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。

7、 RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜。

二、将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜

电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述，真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983），但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。如果琼脂糖中浓度大于1％或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。

（1） 将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。

（2） 用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。

（3） 用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜（Schleicher ＆Schuell BA85或与之相当的产品）。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm，接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如Millipore镊子），用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。

（4） 将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜，其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为未均匀浸湿的滤膜进行 RNA转移是靠不住的。这种滤膜也不必丢弃，可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，高压5分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，装入塑料袋，密封后于4℃保存备用。

（5） 将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。

（6） 用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶， 以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。

（7） 在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之间不应留有气泡。

（8） 用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸， 温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。

（9） 切一叠（5－8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板，然后用500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。

（10） 使上述RNA转移持续进行6－18小时，每当纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。

（11） 转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤约纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。

（12） 从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以6x SSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟，这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从6xSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30分钟以上。为估计RNA的转移效率， 可将胶置于溴化乙锭溶液（0.5 μg/ml ，以0.1mol/L乙酸铵配制）中染色45分钟，于紫外灯下观察。

（13） 将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间，用真空炉于80℃干烤0.5-2 小时。如干烤时间过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空下贮存于室温。

（14） 仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况：杂交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65℃洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。

三、转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的ＲＮＡ染色

当ＲＮＡ自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的ＲＮＡ的优点。

1、方法1

（1） 电泳结束后，含乙二醛－ＤＭＳＯ的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5 μg/ml）的10mmol/L磷酸钠（pH7.0）溶液。甲醛凝胶需用无ＲＮＡ酶的水淋洗，用20xＳＳＣ溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的20x

ＳＳＣ溶液染色。

（2） 于室温染色５－１０分钟，在紫外灯下观察，照像。

（3） 按前所述方法， 将凝胶中的ＲＮＡ转移至硝酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已染色的ＲＮＡ条带。

这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量（如５μg 以上）的ＲＮＡ的情况。

2、方法Ⅱ

硝酸纤维素滤膜上的ＲＮＡ也可以用下述方法染色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色，也可以用经过杂交并经Ｘ光片曝光后的整张滤膜进行染色（Ａ.Ｅfstratiadis，未了表材料）。

（1） 将干燥的滤膜浸入５％冰乙酸中，于室温浸泡15分钟。

（2） 再将滤膜转移至0.5mol/L乙酸钠（pH5.2）、0.04％亚甲蓝溶液中， 于室温浸泡５－１０分钟。

（3） 用水淋洗滤膜５－１０分钟后，可见ＲＮＡ分子量标准参照物带型锐利而poly(A)+mRNA为一模糊带型，由许多长度范围从500碱基以下至５kb以上的各种mＲＮＡ共同组成，mＲＮＡ的平均长度约为２kb。

杂交和放射自显影

固定于滤膜上的RNA的预杂交、杂胶及淋洗等条件，与DNA杂交的相应条件基本相同。现简述如下

（1） 用下列两种溶液之一进行预杂交，时间1－2小时。若于42℃进行，应采用。

50％甲酰胺

5xSSPE

2xDenhardt试剂

0.1％SDS

若于68℃进行，应采用：

6xSSC

2xDenhardt试剂

0.1％SDS

（2） 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0.1μg，其放射性比活度应大于2x108计数/（分．μg）在适宜的温度条件下继续温育16-24小时。切记RNA只与双链DNA 中一条单链互补，因此如用单链探针， 则必须是能与RNA互补的一条单链。

（3） 用1xSSC、0.1％SDS于室温洗漠20分钟， 随后用0.2xSSX、 0.1％SDS于68℃洗膜3次每次20分钟。

（4） 用X光片（Kodak XAR－2或与之相当的产品）进行放射自显影， 附加增感屏于－17℃曝光24-48小时。