苏木素-伊红染色实验（HE 染色）

HE 染色（Hematoxylin-Eosin staining）即苏木精-伊红染色，是病理组织切片最常用的染色技术。

主要使用苏木精和伊红这两种染液，其中苏木精碱性染液为蓝色，可以将组织的酸性结构染成蓝紫色（细胞核呈现蓝色；软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝；粘液呈灰蓝）；伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电荷的阴离子，易于蛋白质氨基中的正电荷结合使细胞浆染色。细胞浆、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色。

原本呈透明的组织切片通过 HE 染色后可清晰地反映出组织结构、组织类型、细胞层次等，能够清晰的在显微镜下观察各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点。

吉姆萨染色主要由碱性染料天青、酸性染料伊红和甘油甲醇配制而成。染色后保存时间长不易褪色，但染色时间较长，细胞质成分及中性颗粒的染色效果较差，对细胞核和寄生虫等染色效果较好。主要用于寄生虫检测或需长期保存的标本涂片。

瑞氏染色主要由碱性染料亚甲蓝和酸性染料伊红溶于甲醇配制形成。染色时间短，对细胞质成分及中性颗粒染色效果较好，但保存时间短易褪色。主要用于临时性检血细胞分析，可以用于观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化。

材料：

1、伊红染料有水溶性和酒精性两种：

伊红水溶液：伊红 Y 0.5 g，蒸馏水 100 ml；或伊红 Y 0.5 g，蒸馏水 100 ml，95% 酒精 25 ml。
伊红酒精液：伊红 0.5 g，80% 酒精 100 ml。

2、苏木精染液：苏木精粉 0.5 g，铵矾 24 g，蒸馏水 70 ml，NaIO 31 g，水5 ml，再加入甘油 30 ml 和冰醋酸 2 ml，混合均匀，滤纸过滤。

3、1% 盐酸酒精分化液：按体积比为浓盐酸：无水乙醇 = 1:99 配制。

仪器：

烤片机、通风橱、免疫组化染色缸或盒、显微镜。

1、石蜡溶解：将切片置于 70 ℃ 原位杂交仪中，烤片 30 min。

2、脱蜡：将烤过后的切片迅速放入二甲苯中，2 次，各 5 min。

3、梯度水化：100%、90%、80%、70% 的乙醇中各放置 5 min，蒸馏水放 5 min。

4、核染：把水吸干，滴加苏木素染色液，染色 5 min，流水冲洗掉苏木素染液，显微镜观察染色程度。

5、分化：1% 盐酸酒精分化 1~3 s，水洗，置于自来水中浸泡返蓝 5~10 min；显微镜观察颜色，若颜色不够深可直接滴加苏木素染色液染色 1 min 后，再次分化立即水洗；若过深则适当增加分化时间。

6、复染：滴加 0.5% 伊红染液 1 滴，染色 10~15 s，蒸馏水清洗后显微镜观察。

7、梯度脱水：80%、90%、95% 和 100% 乙醇进行脱水。

8、透明：二甲苯 2 次，各 5 min，室温晾干。

9、封片：滴加一滴中性树胶于组织上，盖玻片封片。24 h 后置于显微镜下观察拍照。

10、结果

蓝色：正常细胞核呈鲜明的蓝色，凋亡细胞核呈蓝黑色，坏死细胞呈淡蓝色或蓝色消失，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色；

红色：细胞浆为深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈鲜红色，胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

1、二甲苯对人体有害，避免直接接触和吸入，以上实验请于通风橱内进行操作，并注意做好防护。

2、应及时镜检，控制好染色程度。

3、注意充分脱蜡，脱蜡不彻底易造成染色难，染色不均匀，组织细胞结构层次不清晰。

4、无烤片条件也可忽略石蜡溶解直接进行脱蜡，适当增加脱蜡时间。

1、红蓝失调：若整体偏蓝，可能由于苏木素染色时间过长、分化不够，或伊红失效，伊红染色时间太短，分化过度；若整体偏红，可能由于苏木素染色时间不够，分化过度，脱蜡不充分，苏木素染不上，伊红染色时间过长，分化不够。可根据具体原因调整各步骤时间及更换试剂。

2、HE 染色后出现的大白色斑块或斑点：脱蜡不充分，可适当增加脱蜡时间以及更换新鲜的二甲苯。

3、细胞核染色过浅：苏木素染色时间过短，或苏木素失效，或分化时间太长。可重新染色，将组织切片放入 0.01% 氢氧化钠、0.5% 氨水、饱和的碳酸氢钠溶液、乙醇溶液，每个 3~5 min，接着重新染色。可以适当增强组织的嗜碱性以增强核染色，如 Zenker 液固定的切片可放入 5% 碳酸氢钠溶液中 3 h，自来水冲洗 5~10 min 染色，或 Bouin 液固定的切片可放入 5% 碳酸氢钠溶液中 1 h，自来水冲洗 10 min 染色。

4、细胞核染色过深，胞浆着蓝色：苏木素染色时间过长，或切片太厚，或分化时间太短。这种情况首先镜下看看切片厚度（最佳厚度 1~2 层细胞核），要么重新染色，要么重新制片。

5、细胞核呈棕红色改变：苏木素染液失效；或苏木素染色后反蓝不足。应该立即更换苏木素染色液，或在流动自来水（pH 7.5~7.8），或在稀释的氨水溶液，或在 0.2% 碳酸氢钠中适当浸泡，这些步骤均可一定程度地加强苏木素染色后的反蓝效果。

6、伊红染色较淡：伊红的 pH 发生了改变（pH 可能已大于 5），或反蓝液体未漂洗干净，残留后影响胞浆嗜酸性染色，或者切片太薄并且在随后的脱水步骤停留过久。应检查伊红染色液 pH，可使用乙酸调至 4.6~ 5.0。根据具体原因，调整实验步骤。