RACE技术的原理和操作

近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。（相关阅读：精华vol 687 Chapter 4 应用巢式（嵌套式）PCR进行侧翼序列测定）

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60℃ -70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTM RACE技术。邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTTM RACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5' 末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMARTTM RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。

SMARTTM 3'-RACE的原理

利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。