实时定量PCR的原理、探测化学物质及探针优化(二)

1）为了在SG反应后作溶解曲线，引入与溶解曲线起始温度点相同的保温步骤（大约60秒），这样可以确保溶解温度起始于一个确定的温度。

2）溶解曲线分析可以重复。可以在相当一段时间内重新作溶解曲线，甚至到第二天也可以。

3）关于可以用SG检测的引物对的列表

4） 进行SG分析的典型程序是什么？变性：检查反应所用的酶（2min，5min，10min或15min）

循环：95度/20秒，退火温度/20秒，72度/20秒

保温：72度/60秒

溶解：72-99度，on Melt A

5）在哪个通道SG可以被检测？

双通道机型/多通道机型：

发射：：470nm

检测：510nm

多通道机型：

发射：470nm

检测：585nm

6）SG的稳定性如何？

只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。

7）随着mRNA和随后得到的cDNA和DNA的数量和质量的提高，检测到低拷贝数的能力会增强。用到的引物浓度通常是50nM到300nM。

8）利用SG作溶解曲线分析的结果会因以下的因素而有所差别：a）产物的大小 b）产物的GC含量。由于以上的因素单核苷酸多态性（SNP）有可能检测不到。

9）推荐用HPLC纯化引物。虽然对于复制子的扩增没有太大影响，对NTC可能会有很大影响。

10）尽管更长的扩增子也能进行反应，最适的扩增子长度应该是100-200bp。

11）由于很多因素的影响扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。

12）使用SG的一个主要不利因素是引物二聚体的非特异扩增。我们最近利用Qiagen的QuantiTectTM SYBRR Green PCR试剂盒得出相当好的结果。重复试验的结果非常接近，NTC根本没有出现扩增。这个试剂盒对于利用SG扩增低拷贝数的模板非常有用。