Real Time PCR 常用试剂使用说明

简单说明:transhold染料法PCR master mix

Real Time PCR反应液配制（50μl反应体系，染料法）：

使用准备： 引物溶解：先12000rpm离心5分钟，然後用ddH2O溶解成25μM，加水量根据引物合成报告单提供的计算方法计算。

配制说明： 按照以下配方，如果推荐引物加样量如加0.2ul的结果不好，可以调整引物使用量。括号里是第二备选加样量和第三备选加样量。另外，可以调整的参数就是扩增程序的退火温度，请参考说明书。

可以用小体积的，等比例缩小体系。

提高数据重复性的小技巧:

* 配制PCR 反应液时，尽量采用预混再分装的方式。

* 例如，可以计算加同一对引物的标本为5个，准备做三复孔，采用15ul体系，引物浓度为200nM(按照上面表格是加0.4ul的），就可以用以下的加样方式： （比5份稍微多一点），总共为130ul的2*PCR master mix，2.1ul的上游引物，2.1 ul的下游引物，加dd水至235ul；混匀分装至每管45ul，每管加待检测样品5ul，混匀平均分装成三管，每管15ul。

加样的注意事项：

1、注意加样枪的使用，加样时不要把枪头伸入液面下，避免挂液误差；

2、要使用低吸附的进口枪头，避免每次的残留导致的加样误差。

3、正确的加样方式：离液面1-2mm，加液，不靠壁，不贴液面。

混匀平均分装的注意事项：

1、第一管吸液前需要先把枪头在液面中浸润一下，以保证三复孔的枪头吸液量是差不多的。

2、用混匀器进行混匀，不要用移液器吹打。

详细说明书

transhold cat. A2010A0112

荧光定量PCR Premix试剂盒(荧光染料)

（FQ-PCR PreMix Kit）(除LIGHTCYCLER)操作说明书

【前言】

本试剂盒提供了进行简便、灵敏的PCR（或荧光PCR）检测的完整系统，包含了经过优化的缓冲液、dNTP、热启动Taq DNA 聚合酶混合物、MgCl2溶液和预混的SYBR GREEN染料，成为一个即时可用的混合物。您不必再花费时间去混合试剂，同时确保了结果的一致性和可重复性。使用定量PCR Premix试剂可进行实时荧光PCR检测，获得方便、灵敏和准确、可靠的检测结果。

【规格】

50人份

【试剂盒组成】

定量PCR Premix试剂混合物(2X): 1.25 ml

【反应液配制】

（1） 反应体系中，引物常规终浓度可设为200nM。反应性能较差时，可以在0.05～0.9 μM（50－900nM）范围内调整引物浓度。

（2） 在25 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

（3） 适用的荧光定量PCR仪：ABI，MJ RESEARCH,BIORAD,STRATAGENE等，ROCHE品牌仪器由于光路不同，可能无法得到满意结果。

【扩增条件】

以ABI7000为例，Detector设为SYBR,QUENCHER设为NONE, 1、 当引物TM值≥60℃时，推荐： 95℃ 15分钟→95℃ 15秒→60℃ 1分钟℃→溶解曲线分析 40～50个循环（可选）

2、当引物TM值<60℃时，推荐： 95℃ 15分钟→95℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 45秒→溶解曲线分析 40～50个循环（可选） 用户可根据自己的用途和引物、探针设计的具体情况来确定适合的退火温度，退火时间和循环次数。

【使用注意事项】

1、 冻结制品融解後请上下颠倒轻轻均匀混合，避免振荡器等剧烈搅拌。混匀制品後请用离心机轻微离心後使用。应在使用前应充分融化，混匀，离心数秒，使液体集中在离心管底部。

2、 本制品使用前请于-20℃保存，融解後的制品请于冰上放置，使用後请立即保存于-20℃。

3、 尽量避免多次反复冻融，如果需要多次使用时，请在第一次融解後将制品按适当量分装後保存。

4、 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。

5、 引物设计过程中尽量避免发夹结构、引物二聚体结构的发生。目标片断最好在250bp以内，尽可能在150bp以内。

6、 反应体系中，引物常规终浓度可设为200nM（上游引物200nM，下游引物200 nM）。根据您的保存浓度不同，计算加入的引物量，使体系的终浓度保持相同。引物浓度的计算方法可以参考：《荧光定量PCR实验指南》。必要时您也可以根据体系的不同，来优化引物浓度。反应性能较差时，可以在0.05～0.9 μM（50－900nM）范围内调整引物浓度。

7、 如果使用其他体积的体系（10-50μl），应保证终浓度与说明书上的终浓度一致。

8、 在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性薄壁进口200μl PCR管、移液器头(带滤嘴自卸式)，不能用手直接触摸PCR反应管。

9、 操作台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸钠及/或70%乙醇擦拭消毒。实验房间、超净工作台应定期及每次实验後用紫外灯处理。

10、 试剂盒请在保质期内使用。

11、 配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。

12、 实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。

13、 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，避免产生气泡。如果产生气泡，请用手指将气泡弹破，再低速离心。反应体系配制完毕後低速离心数秒，立即进行PCR扩增。