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PCR

免疫PCR技术

2024-11-18 PCR 加入收藏
(一)材料与方法1. 生物素标记特异性抗体的制备免疫球蛋白(如IgG、IgM)的Fc片段上有糖基存在,因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生

(一)材料与方法

1. 生物素标记特异性抗体的制备

免疫球蛋白(如IgG、IgM)的Fc片段上有糖基存在,因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生物素标记。

(1) 将纯化的抗体(IgM或IgG, 0.1~1.0ml)在标记缓冲液(0.1Mol/L NaAc,pH值5.5, 0.1Mol/L NaCl)中4℃透析过夜。

(2)吸取0.5ml至微量离心管中,加过碘酸钠溶液至终浓度为10mMol/L,置冰浴上于暗处孵育30min,使抗体分子上的糖基氧化。

(3)将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱,使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。

(4)向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至终浓度5mMol/L,置混摇器上室温孵育1h。

(5)用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱,将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰,保存-20℃。

2. 生物素标记DNA片段的制备

作为将与抗体偶联的报告DNA片段,应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列,如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。

DNA片段大小为300~500bp,生物素标记可采用PCR方法,根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物,其中一个引物的5’端碱基上带有生物素标记。在0.5mlPCR管中按表将下列试剂混合。

95℃加热5min,然后在PCR仪上按下列程序扩增:94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min; 40个循环。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提,然后加10ul 3Mol/L Kac,250uL无水乙醇,置-70℃ 30min。离心沉淀DNA片段,用70%乙醇洗一次。 将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中,保存在-20℃。

3. 制备抗体-亲和素-DNA复合物

将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中,室温孵育30min,再加入两倍分子浓度的生物素标记的DNA片段,继续孵育30min,最后加入10倍分子浓度的生物素,将亲和素分子上的结合部位饱和。

最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开,加入BSA达1mg/ml,分装后冻存于-20℃。

4. 免疫PCR

(1) 按常规ELISA方法,用饱和缓冲液稀释抗原,加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中,4℃过夜。

(2) 用PBS洗三次,然后每孔加200ul封闭液(PBS含10mg/mlBSA,1mg/ml鱼精DNA),室温孵育30min。 (3) 用TETBS(其配方:20mMol/L EDTA,0.02%NaN3)洗三次。

(4) 将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中,每孔加50ul,室温孵育1h。

(5) 用TETBS洗5次,然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。

(6) 每管中加50ulPCR反应液,含有表成分:


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