Access RT-PCR系统

2)什么是Access RT-PCR系统？ 3)总RNA能否作为模板，是否一定需要poly(A)+RNA? 4)使用Access RT-PCR系统需要的RNA的量是多少？ 5)同一般常用方法相比较，Access RT-PCR系统有哪些优点？ 6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件？ 7)Tf1DNA 聚合酶 是否有反转录酶活力？ 8)为什 Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶？ 9)在使用反转录系统时，能否用氯化镁代替硫酸镁？ ------------------------------------------------------------- 1)什么是RT-PCR？ RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）,和cDNA的 聚合酶 链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。 2)什么是Access RT-PCR系统？ Access RT-PCR系统用于从总RNA或mRNA中, 对特异RNA模板进行反转录（RT）和聚合酶链式扩增（PCR）。这一系统在单个管子中，使用两个酶，可对极其稀少的RNA进行灵敏,快速,重复好的分析。这一系统使用禽类成髓细胞瘤病毒的 反转录酶 合成cDNA的第1条链，用来自黄栖热菌的热稳定 Tf1DNA聚合酶合成cDNA的第2条链,和PCR扩增DNA。 3)总RNA能否作为模板，是否一定需要poly(A)+RNA? RNA模板可以是总RNA， mRNA[poly(A)+RNA], 或者合成的RNA转录产物。无论使用何种RNA，关键是保持在RNA提取过程中无RNA酶污染。使用Promega公司的SV总RNA提取系统（目录号Z3100和Z3101），RNAgents 总RNA提取系统(目录号Z5110)和PolyATtract-mRNA提取系统,所获得的RNA的纯度好, 适用于Access RT-PCR系统。应注意降低提取所得RNA中残留DNA的量。用Promega公司的RQ1无RNA酶的DNase（目录号M6101）处理RNA样品（随后抽提和沉淀）,除去其中残留的DNA。 4)使用Access RT-PCR系统需要RNA的量是多少？ 使用Access RT-PCR系统扩增RNA的低限取决于模板和引物。用正对照RNA，RNA量的低限为103个分子。总RNA模板的量在1pg-1ug的范围内，poly(A)+RNA模板的量在1-100ng的范围内, 可获的很好的结果。 5)同一般常用方法相比较，Access RT-PCR系统有什么优点？ Access RT-PCR系统在单个管子中完成反应，不需要对反应混合物作任何添加，同一般常用方法相比, 减少了操作时间，减少了污染反应混合物的机会。同单酶反应相比较，即用r TthDNA聚合酶对总RNA中的目标RNA作扩增，双酶反应更灵敏。 6)使用Access RT-PCR系统需要优化哪些条件？ 有多个因素需要优化以获得最佳引物模板结合,这包括硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的次数。 A)Access RT-PCR系统中AMV 反转录酶 和Tf1DNA聚合酶对镁的需要受 核苷酸 ，引物和模板终浓度的影响。建议选择0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸镁作初步实验。 对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。 C)大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察倒。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。 7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力？ Tf1DNA聚合酶本身在测试的条件下不具有反转录酶活力。 8)为什么Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶？ 要使反转录有效，必须消除RNA中的多数次级结构。为次，合成cDNA的第1条链必须在较高的温度下进行。MMLV反转录酶能采用的最高温度是42oC, AMV的活力在Access RT-PCR系统中可以达到48oC。因此，使用AMV反转录酶，可以消除RNA次级结构的负面影响。 9)在使用反转录系统时，能否用氯化镁代替硫酸镁？ 不能用氯化镁代替硫酸镁。Tf1DNA聚合酶在用硫酸镁和AMV/Tf15X反应液中的的活力有很大提高。