临床拭子标本DNA PCR反应模板的制备

此方法适用于各种拭子标本（鼻、咽、口腔和生殖道等）中DNA的快速制备。

试剂与配制

PBS-2×Fungi-Bact液；生理盐水；无水乙醇；TE缓冲液；钾缓冲液：50mmol/L KCl，10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml）；

操作方法

一、采样：

1. 用无菌生理盐水润湿消毒的棉签蘸取鼻、咽、口腔和生殖道等表面的上皮或感染的表面，将沾有标本的棉签置于2mlPBS-2×Fungi-Bact液中。如样本在24 hr内处理，可室温保存，否则存于4℃；

2. 动物组织用生理盐水漂洗一次，切成宽度小于1cm的小片，用等体积的生理盐水悬起，边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，室温下可保存数日，4℃可保存数年；

3. 肝素或柠檬酸抗凝血室温保存1～2d后仍能进行DNA分析，保存用于DNA分析的血样品的较理想的，也是最简单的方法就是将血涂于玻片上干燥保存。100μl血涂片含有5×105  个细胞，相当于3μg哺乳动物细胞核DNA。

二、DNA的制备：

1. 2000rpm离心10min，沉淀细胞；

2. 弃上清，如有残留的血液，则再用1mlTE缓冲液悬起细胞沉淀并转移至Ep管中，10000g离心30s，沉淀完整的细胞；

3. 除去上清（内含有红细胞裂解成分），如仍有残留血液，可重复（2）和（3）直至沉淀细胞无红细胞痕迹为止；

4. 用50～300μl钾缓冲液悬起细胞沉淀，使细胞浓度为10～1000个细胞/μl；

5. 55℃保温1hr，消化裂解细胞，释放DNA；

6. 95℃保温10min，灭活蛋白酶K；

7. 处理的样品可储存于-20℃。