RT-PCR实验方法简介

RT-PCR定义：

是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。

RT-PCR流程简介

一、抽提RNA：

1、防止RNA酶污染180℃的高温下干烤6hr以上；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；去污剂洗涤，双蒸水冲洗；溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用；操作人员戴手套；器械专用。

2、材料的准备

组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下；尽量避免材料的冻融 。

3、确认RNA的质量

检测RNA溶液的吸光度：OD260/OD280=1.8－2.0

RNA的电泳图谱：28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。

二、反转录：

单管一步法:

反转录和PCR反应在一个管子中完成 ，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增 ，灵敏度更高，但是容易相互干扰 。

两步法:

反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。

三、PCR：

1、参照基因 PCR

参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量 的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍；

参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参；

参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参；

由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。

2、目的基因PCR

典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

RT-PCR实例：

1、实验材料：拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序

2、实验目的：分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异

3、实验步骤：设计ACTIN及G1基因的引物；分别抽取野生型Ws及突变体m1、m2花序RNA，DNase I处理，以尽量去除基因组DNA；电泳检测，估计RNA总量；取1ug左右的RNA进行反转录；

取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－25个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR；

取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。

以G1基因引物，按调好的模板体积做PCR，电泳。