PCR技术：样品处理与注意事项

一、样品处理

DNA是染色体的主要组成部分，是PCR的扩增模板。要进行PCR，研究DNA结构与功能或者用于诊断目的，首先必须从生物体内提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色体DNA平均大小为3.0×109bp），提取DNA应尽量保持DNA完整性和纯度，即在提取中尽量避免机械张力引起的DNA分子降解，又要注意杂质及蛋白的去除，防止胞内酶解DNA。

因此，提取DNA的基本过程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚及胞内DNA酶失活，然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白质，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，最后用乙醇沉淀得到DNA。

理论上PCR对模板DNA纯度及完整性要求并不高，细胞经过热变性使DNA释出就可以作为模板，依赖引物的选择性进行扩增。

这对拷贝数很多的基因组，确实如此。但当待扩增的拷贝数甚少而无关细胞甚多时则扩增就不易成功，其原因是：

①非希望的扩增增多，掩盖了所需扩增的片段，使其数量减少至不能检测到的程度。

②生物样品中的杂质会抑制PCR反应，最主要的是血液和琼脂糖。

例如在100μl反应液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血红素也会引起明显的抑制。对于含血液的样品，可以用渗透压溶解红细胞，离心集取细胞核，洗除血红蛋白，再用蛋白酶/表面活性剂处理的方法来解决。另一简单的方法是煮沸之，使释放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。

现将PCR前处理各种标本的基本方法介绍如下：

1、所需溶液

（1）PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0

（2）含表面活性剂及蛋白酶K的PCR缓冲液

50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2，0.1mg/ml明胶，0.45%NP40,0.45%吐温20

高压灭菌，冷冻储存。临用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K（水溶液）至100μl溶液中。

（3）溶血缓冲液

0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5 ，5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100

2、提取方法

（1）用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法从血液或培养细胞分离的单核细胞（当PBC〈10%细胞数时用此程序）

①将细胞样品用PBS稀释至10ml，置15ml锥形离心管中；

②100×g离心2～5min，吸去上清；

③细胞再悬浮于10ml PBS中重新离心洗涤；　

④沉淀物悬浮于溶液2中，使细胞浓度约为6×106/ml，移至1.5ml管中；

⑤50～60℃保温1h；

⑥95℃保温10min使蛋白酶变性；

⑦冷冻储存。

如果RBC多于细胞的10%，则用PBS洗1次（步骤1，2）后，悬浮于1ml溶液3，并转移至1.5ml离心管中，如程序B-2离心1次，再悬浮于溶液2中按程序A-4继续进行。

（2）全血：此法使胞膜溶解故胞浆DNA丢失，约可得20μg DNA/0.5ml血。

①0.5ml全血与0.5ml溶液3共置1.5ml管中；

②13000×g离心20s；

③吸去上清，加1ml溶液3，旋涡混合使沉淀重新悬浮；

④重复第2，3步2次；

⑤13000×g离心2s，吸去上清，悬浮于0.5ml溶液2中；

⑥按程序A5～7步进行。