PCR技术系列十五：个体配子DNA序列的PCR分析

高等生物遗传图谱的构建依赖于选择性杂交后代的分析或者通过家系分析法来计 算连锁关系。对人类而言仅后者是可行的。使用长度多态性限制片段（RFLPS）在构 建人连锁图谱方面已取得长足的进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基 因进行定位，首先得建立间隔约10CM的遗传标记束（平均1CM等于1％重组），这样没 有基因离标记RFLP的距离会超过5CM.可靠的统计表明家系分析能够检测的遗传间距 精确到1cM(1cM相当于1000kb的DNA.分析更小的遗间距需要检测家族内大量的个体， 而这实际上是行不通的。

最近发展了一种不依赖遗传交叉或家系分析的方法检测遗传标记间的重组频率。 具体方法是直接决定配子(精子)的基因型是亲本型还是重组型。这通过确定两个等位 基因中哪一个存在于双杂合男性精子上的两个基因座点其中之一来完成。根据上述方 法确定的重组精子的数量被总检测精子数除就可估计出重组频率。已知聚合酶反应在 体外扩增基因能够使DNA扩增109倍，因此该技术有可能分析精子中单分子靶DNA.以 这种方式研究数千个人精子就有可能构建比家系分析要精确得多的遗传图谱。该方法 提供了一个独物的手段来研究许多现在被认为是不能解决的人类遗传学领域的难题。

用PCR确定精子类型的原理

从人类家系分析的观点来看，每个个体都是亲本减数分裂产生的单个产物的融合 体。双亲以及后代体细胞DNA的研究加上适当的统计学方法可推知形成合子的减数分 裂产物的重组或非重组的性质，同时可以估计重组在减数分裂中所占的比例。我们研 究遗传重组的方法与上述的不同，它通过分析减数分裂产物本身的DNA来决定减数分 裂发生重组的比率。每个男性一生中可产生大量的减数分裂产物精子，从而提供了进 行遗传分析取之不尽的实验材料。

假设一个男性杂合子有两个连锁基因座。每一个基因座的多态性差异在于AT-AT 或GC-GC)要么是重组型(AT-GC或GC-AT)。重组类型出现的频率将取决于两个基因座彼 此间的遗传间距。通过检测某一个体的大量精子，可精确地计算出四种精子类型出现 的频率。该技术存在的困难在于确定减数分裂前细胞中的每个基因座上存在的两种等 位基因中的哪一个进入单个精子。常规的分子生物学技术没有足够高的灵敏度分析精 子染色体DNA的单个分子。

PCR扩增每个基因座的多态性区域是分析精子的第一步。两个基因座用两组引 物，同时引物必须位于多态性区域的边侧。当精子两个靶序列经PCR扩增，就确定了 每个基因座的等位基因成份。人工合成的寡核苷酸探针可识别等位基因小到仅发生单 个碱基置换的实验方法已得到改进，这些等位基因牧场划的寡聚物（ASO）探针第一 次应用是将人正常β珠蛋白基因中的正常βA等位基因与镰刀形红细胞（βA）的突变 区分开来。本方法检测等位基因需要人工合成的小片段寡核苷酸（典型的长19bp)。 每个寡核苷酸与一个等位基因完全互补而与另一个等位基因通常只有一个碱基的差 别。同位素标记的寡核苷酸分别与待检测扩增的DNA样品杂交。在适当的杂交条件 下，只有样品中的序列完全互补时，寡核苷酸可形成稳定的双螺旋。例如，精子的 PCR产物用四种ASO探针分析。有一对ASO分别将基因座1的两个等位基因区别开，另一 对将基因座2的两个等位基因区别开。实际上，预期两个ASO中只有一个与某一个减数 分裂产物杂交，可以确定每个检测的精子对于所研究的染色体而言实际上是单倍体。

人单倍体细胞有1.5-5X10-24摩尔单一DNA序列。根据以前的实验结果，我们知道 活性达5μCI/微微摩尔的同位素标记就能够在不到一天的时间内检测出1毫微微摩尔 （10-15/10-24）。即使以较低的平均扩增效率，大约经50个扩增循环便可完成。

单个细胞的PCR分析

单个二倍体细胞

在分析单精子以前，Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两 个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6（βS）发生突 变，另一个纯合子则来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的 引物，及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯 事细胞和βB纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显 微镜观察到的混合培养的单个细胞转入溥塑料胡管内。分别将单个细胞转入含裂解液 的PCR管中，保温后，加入PCR缓冲液，缓中有四种dDNP．Taq DNA聚合酶和扩增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA，然后根据已发表方法的改进方案进行 50全循环的扩增。通过打点杂交，等量的扩增产物打点于尼龙膜后，扩增产物分别与 βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84％细胞只与βA和βS探针杂交，杂交 强弱各不相同；19个与βA探针。12个与βS探针杂交。12个以水作空白对照的反应管 中瓜呈阴性，它表明忽略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品，它暗示转 入到反应管中的单个细胞，而且组织培养基中存在的从βA或βS细胞中裂解出来的 DNA并未吸附在单个细胞上。

单个细胞的PCR扩增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带蛋白基因的质粒 DNA样品在杂交模上的杂交信号的强度进行比较确定。据估计PCR反应开始时，一个二 倍体细胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩尔）在5－500毫微微摩尔之间，每个PCR循环以 平均效率65％计算，经50个循环后它的DNA相当于平均扩增了7.6×1010倍。考虑到扩 增的程度之大，因此排除任何可能的污染对于单个细胞的分析十分关键。

单精子的分析

Li等人随后对位于染色体19编码LDL受体(LDLr)的基因的杂合体单精子的基因型 进行分析。根据已知的DNA序列，他们用PCR和ASO分析检测LDLr的RFLP.PCR的引物和 探针以前已有报道。单个精子的分离与二倍体细胞的分离方法一样，精液经蔗糖梯度 离心得到纯化的精子，精子于－20℃可保藏8个月。显微镜下将单个精子吸入毛细塑 料针管内，然后转入试管内以作裂解。裂解的方法与发表的方法冲液(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明胶），0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS.37℃保温1小时，加入PCR反应物以前，样品加热到85℃。PCR扩 增。对80个精子LDLr基因型已作过分析。55%的雄配子显示出杂交信号。22个携带 LDLr等位基因，21个携带LDLr2基因。仅一个与两种探针杂交都呈阳性。16支对照反 应管中加入所有反应试剂但没有精子，结果无杂交信号出现。两个扩增的等位基因的 分布遵循Mendel独立分离定理，它表明PCR反应以单个减数分裂产物为起始，无污染 的二倍体DNA存在。

Li等人随后又对进行重组研究十分关键的单精子的两个不同基因座的DNA序列进 行扩增。供体雄配子的第六条染色体上的HLAAQα基因座及第十九条染色体上的LDLR 基因是杂合的。最初想在LDLR和DQα引物存在的条件下同时扩增两个基因座的全序列 的努力未能成功。取而代之，在两对引物存在时，先扩增20个循环，经这种最初扩增 以后，将1／50反应混合物加入试管内，用只含HLA引物的PCR缓冲液稀释，另一份同 等量的反应混合物经只含DLDR引物的PCR缓冲稀释，再进行45个扩增循环以后，用第 二次反应产物的一部分与具有等位基因位点特异的两个ASO杂交。123个样品（85％） 有杂交信号。剩下的27个样品无扩增位点。123个样品中有9个至少发现在两基因座其 中之一有两个等位基因，而对这些样品未作进一步的分析。这些样品中可能有不同基 因型的两种精子，而不是由于减数分裂连锁造成的。因为最近细胞学有关人精子的研 究结果表明单个染色体的平均连锁频率在0.1％水平，远远低于所观察到的频率。

在剩下的114个精子中，LDLR基因座有96个已经定型，其中45个为LDLRL、51个为 LDLR2.两等位基因的比率理论值为1：1（平方差＝0.375，0.75>p>0.5ldf)88个的 DQα等位基因的分离处于具有统计学意义的临界值（平方差＝3.68，0.1>P>0.05， ldf)。上述结果表明：1）统计上的不稳定性，2）由于该基因座具有大量的多态性， PCR引物与供体DQαDNA序列之间的错配导致两个DQα等位基因不均等扩增，或3）一 些异常的遗传现象如异常分离。

114个精子中有70个（61％）在两个基因座可见到杂交点。染色体6和染色体19的 独立分离应该出现同频率的四种可能的配子：DQA1，LDLrl;DQA1，LDLr2;DQA2， LDLfrl;DQA2，LDLr2.Li等人观察的结果每种类型分别为21，18，14和17个，这些结 果与所预料的分布无明显差异（平方差＝1.43，0.75>P>0.5，3df）。结果表明可以 同时在两个不同的遗传位点可靠而有效地确定单个精子的基因型。

在有一个杂交信号的114个杂交样品中，18个有两个DQα等位的基因中的一个， 但LDLR产物未能检测到。26个精子有两LDLR等位基因中的一个，但没有扩增HLA基因 座。由于已知连锁不大可能扩增，因此在这些精子中被研究的这两个染色体有一个是 缺对的（缺对染色体）。

LDLR和DQα基因座扩增的相对频率几乎是相等的。141个样品中88个扩增DQα。 96个扩增LDLR.因此检测DQα和LDLR扩增产物的可能性分别为62％和68％。上述结果 仅为估计值，因为实际上不能够确定141个样品都只含有单个精子。

但可用下列数据估计样品的预期频率：1）两个基因座上的单等位基因的扩增， 2）仅一个位点的扩增，或3）假设每个基因座的扩增是独立进行的，没有基因座笪到 扩增。结果表明69个精子的两个基因座的单等位基因被扩增了，45个只有单个基因座 的单等位基因进行了扩增，27个无基因座扩增。当观察的实验结果与独立扩增的频率 相比较时，结果具有很高的统计学意义（方差＝13.0，P>0.995，2df）。其余的精子 则只有两个基因座的扩增或无基因座扩增，以及远低于预期的两个基因座中单一位点 扩增。结果与裂解的雄配子适宜于两个基因座的扩增或未裂解的精子不能够进行两个 基因认的扩增相一致。因此，如果样品裂均匀，两个基因座的扩增就可能不是独立进 行的。因此，一个靶DNA分子同PCR反应物的亲和性与其它靶DNA分子的亲和性成正相 关性。可以通过改进裂解过程进而增加靶DNA的亲和性来提高单精子的扩增率。