以硅膜为基础纯化 PCR 产物实验方法

乙醇 PCR 样品
真空装置 真空泵 真空废物收集装置 真空管 PCR 纯化系统

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

乙醇，80%(75 ml/板；使用前配制）

2. 核酸和寡核苷酸

在 96 孔板中的 PCR 样品（每样品 20?lOOul)

3. 特殊设备

Vac-man96 真空装置（Promega) 或类似真空装置

能产生 15?20in(lin=2.54 cm) 汞柱压力的真空泵

真空废物收集装置（1L 规格）

真空管

4. 其他

WizardSV96PCR 纯化系统（Promega; 包括结合板、收集板、DNA 洗脱板、膜结合液和无核酸酶的水）

二、方法

1. 如图 9-8 所示准备真空装置。将结合板放置于真空装置底部。为了确保样品板上的孔与结合板上的孔一一对应，把结合板上有数字标记的一侧朝向真空装置中的真空口端，在真空装置基部的真空口处贴上一条真空标记线。

2. 向 96 孔板的每个 PCR 样品中加入相同体积的膜结合液（如在每 lOOulPCR 样品中加 100ul 膜结合液）。

3. 抽吸混合，将全部样品转移到放置在真空装置上部的结合板的孔中，室温下温 lmin。

4. 抽真空直到样品通过结合板（约 30s), 释放真空。

5. 向结合板的每个孔中加入 200ul80% 乙酹，室溫下溫育 1 min，抽真空直到乙酵通过结合板（约 30s)，释放真空。

6. 重复步骤 5 以使 200ul 80% 乙醇洗涤的次数达到 3 次。

7. 最后一次洗涤中，当结合板的孔变空后，继续抽真空 4 min 使结合基质干燥。

8. 关闭真空，松开真空装置底部的真空线并使之猛吸入位于真空装置垫圈内的其空端口中。从真空装置基部移开结合板，在干净纸巾上轻拍使之干燥并除去残留的乙酵。

9. 将 96 孔 U 形底的收集板放置于真空装置底床中，上面装上真空装置垫圈，要把形底收集板有数字标记的一边朝向真空端口。

10. 如图 9-8 所示，将结合板放置在真空装置垫圈和收集板之上，结合板的尖端必须对准收集板孔的中央，两板必须同向。向结合板每孔加 l00ul 无核酸酶的水，室温下温育1min，抽真空直到溶液通过板（约 1min)。

11. 释放真空并取出结合板，小心移开真空装置垫圈，确保收集板仍位于真空装置床中。如收集板壁仍留存有小液滴，短时间离心板以将小液滴集中到孔底。洗出液的体积可能不同，大约为 75ml。