PCR技术与癌基因检测研究现状

PCR 在突变基因检测中应用

　　基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因,检测与遗传病及恶性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学,医学遗传学及肿瘤学研究的热点,它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要的意义。分子生物学技术的发展,尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础,结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途径,并取得了令人瞩目的成果 ［1,2］ 。

　　广义而言，基因突变包括点突变,染色体突变和基因组突变3 种形式,只是它仍所涉及的范围不同,后两种基因突变涉及的基因较多,可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中期的染色体而检出，亦可在间期用标记探针检出,点突变通常涉及的范围较少,是肿癌和遗传病发生的主要分子改变[3-5] 。因此,它是基因分析的主要研究内容。不同类型的基因突变有不同的检测途径,大致方法包括:应用基因探针直接检测；应用PCR技术检测；利用探针技术进行分析等。

　　PCR技术是一门新型快速诊断技术,它利用热稳定的DNA合成酶-Taq多聚酶,在体外合成特异的DNA片段,两条寡核苷酸引物结合在待扩增DNA的两侧,通过反复循环的DNA变性,退火和延伸,短时间内可使目的DNA得到大量扩增。这种方法是检测癌基因的最有效方法,尤其是癌基因在结构上微小改变如重排,缺失,扩增,突变等都能快速诊断。癌基因表达水平的高低也能用定量PCR快速诊断,尤其运用PCR定点突变技术可以改变物种的遗传性状,在肿瘤的基因治疗方面得到广泛应用 [6、7] 。

　　以PCR技术为基础建立的基因突变检测技术有多种,但目前较为广泛应用的为PCR-SSCP、PCR-ASO及PCR循环直接测序等,现介绍如下。

1．PCR-RFLP技术 PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析。主要包括靶基因PCR扩增和扩增的DNA片段限制性酶切图谱（长度多态性）。可将目的基因片段扩增百万倍以上,而且无需标记或放射性探针杂交过程。主要用于核酸变异性分析与比较,当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排,使某种酶切位点增加,减少或消失,导致限制性酶切片段长度发生改变,就产生了限制性片段长度多态性,由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点,根据其识别序列的位置和数量,可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳,将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性（片段的大小）。PCR-RFLP用于基因分析具有分辨率高、重复性好、简便快速直观等优点,主要用于微生物的分群分型分亚型、癌基因分析、遗传病的诊断、HLA分型及载脂蛋白基因的分析等。

2. PCR-SSCP技术 PCR-SSCP是聚合酶链反应一单链构象多态性分析（single strand conformation poly morphism）,原理是将经扩增的DNA片段经过变性处理,形成单链,由于序列不同,单链构象就有差异,在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同,通过与标准物的对比,即可检测出有无突变。SSCP技术具有经济、快速、灵敏等特点。

3. PCR-southern blot或dot blot技术 是将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再与标记的特异性探针进行杂交,然后放射自显影,检测有无特定的扩增片段及相对含量,可以直接检测癌基因的点突变,缺失及重排,比PCR产物EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高10倍以上。由于非放射性同位素标记探针的应用,使得PCR-southern blot应用更简便,现已广泛应用于癌基因,遗传特异基因,病原体特异基因等方面的研究及检测。PCR-dot blot即将PCR扩增产物变性后直接点在膜上,与标记的特异性探针进行杂交,它耗时短,可用于半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品,缺点是只能看到一个斑点,必须小心控制反应条件,设立阳性及阴性对照,以便对待检测标本做出正确鉴定。

4．不对称PCR直接测序法 扩增产物的测序,可以很容易确定群体中某一特定基因的序列变异情况,这种方法是了解目的基因突变的最理想方法。在扩增反应中加入不等量的两段寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得单链DNA,然后利用双脱氧法直接测序,即确定有无突变。

5．原位PCR技术 即聚合酶链原位扩增技术,是将PCR技术与原位杂交技术结合起来,不改变与周围组织的原位位置关系,直接在组织,细胞或病原体原位研究基因变化的技术。不仅能提高了杂交的灵敏度,又能直接置显微镜下观察病变部位,而且标本不需特殊处理或制备,不需标记探针,较省时和经济,尤其对形态学研究具有其它方法难以比拟的优点。原位PCR已在神经性疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得到广泛应用。

部分癌基因PCR 及其临床意义

　　与临床诊断有关的癌基因可分为3类,即肿瘤非特性癌基因,肿瘤特异性癌基因和暂未证明临床意义的癌基因。用于临床诊断的癌基因主要前两类,包括致癌基因与抗癌基因,转移基因和转移抑制基因。目前PCR在临床主要用于:(1)检测血液系统恶性肿瘤染色体易位,尤其对微小残余病灶的检测,有助于判断白血病的疗效。(2)通过对活化的癌基因的检测,来快速分析肿瘤的预后。(3)检测肿瘤相关病毒,发现与人类癌症相关的病毒,并对其进行分类,以指导治疗。(4)检测肿瘤的抑制基因的改变,分析肿瘤发生机理及判断预后。(5)用于肿瘤的抗药性基因分析,为肿瘤的化疗提供选择方案。(6)通过对转移基因及转移抑制基因检测,判断肿瘤有无转移,为手术治疗提供依据。

1. ras -PCR[8 、9] ras 基因家族由H-ras,K-ras 和N-ras 组成。在人类肿瘤中ras 基因激活的主要方式是点突变,而且常位于第12、13、59或61位密码子处,不同的ras 基因在不同的肿瘤具有优势激活现象。胰腺癌,结肠癌,肺癌以K-ras 突变为主,在急性淋巴细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病等血液系统肿瘤中以N-ras 突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras 突变为主。检测ras基因突变,对判断这些肿瘤的发生发展以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义。检出ras基因改变的意义:(1)ras基因改变是一个早期改变,提示细胞正处于恶性转化状态,预示体内存在肿瘤发生潜在的可能。(2)在发现肿瘤后,若检出ras 基因突变,预示为恶性肿瘤。(3)良性肿瘤患者,若检出ras 基因突变,预示存在恶性变可能。(4)正常人血中检出ras 基因异常,预示为肿瘤易感,有肿瘤发生的潜在条件。

2. c-myc -PCR[10-12] c-myc 基因既是可易位基因,又是受多种物质调节的可调节基因,也是一种可使细胞无限增殖,促进细胞分裂的基因。c-myc 基因还参予细胞凋亡。在肿瘤发生中,c-myc 基因主要使细胞无限增殖,获永生化,促进细胞恶性转化的作用。c-myc 基因在骨及软组织肉癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌、视网膜细胞瘤、神经胶质瘤、小细胞肺癌、何杰金氏病等中存在扩增与过度表达,c-myc 扩增与高表达、肿瘤早期复发及转移密切相关。研究表明,c-myc mRNA高水平表达是结肠癌直肠癌及肠息肉癌变的一个重要生物学标志物。因此,用PCR检测c-myc基因的变化对监测肿瘤的发生发展及预后有重要意义。

3. p53 -PCR[13 、14] p53 基因是最重要的抗癌基因,编码分子量为M r53 000的蛋白,几乎参与所有肿瘤的发生发展。p53 在肿瘤中的主要改变有突变、重排、缺失、其中突变是主要的激活方式,最常见的突变部位在第5-9外显子区域。在肝癌中几乎都存在249位的密码子突变,检测249位有无突变可用于辅助诊断肝癌。在乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等中都存在p53 突变。PCR检测肿瘤中p53 基因可用以判断肿瘤的发生发展和预后。检出p53 基因的临床意义:(1)p53 改变是细胞恶性变的晚期,预示肿瘤的发生不可避免。(2)正常人血中检出p53 异常,预示不久肿瘤发生。(3)发现肿瘤患者,若检出p53 基因异常,预示患者生存期缩短,预后差。(4)术后患者血中检出p53 基因异常,预示肿瘤有可能复发。

4. p16 -PCR[15-17] p16 基因是一种细胞周期中的基本基因,直接参予细胞周期的调控,负调节细胞增殖及分裂,具有控制细胞分化,阻遏肿瘤的生成作用。其失活与人类50%的肿瘤发生发展有关。研究表明,p16 基因在肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤中存在突变与缺失。检出p16 基因异常的临床意义:(1)从血中检出p16 基因，预示体内存在过度增殖的转化细胞。(2)若从肿瘤患者中检出p16 基因，预示肿瘤为恶性肿瘤。(3)术后患者检出p16 基因,预示存活期短、预后差。

5. mdm2 -PCR mdm2 基因是重要的癌基因,它编码的P90蛋白能够与p53 结合,使p53 基因失去正常功能。已在骨恶性肿瘤中检出mdm2 ,而且mdm2 扩增与骨恶性肿瘤转移相关。mdm2在食道癌、乳腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、鼻咽癌、脑神经胶质瘤中mdm2扩增与高表达。通过PCR检测有无mdm2 扩增与过表达,可以作为判断相关肿瘤预后。检出mdm2 的临床意义:(1)正常人血中检出mdm2 ,提示体内存在恶性细胞的可能。(2)骨肿瘤患者检出mdm2 ,预示肿瘤存在转移。(3)术后患者如检出mdm2 异常,预示肿瘤存在复发。

6. nm23 -PCR[6] nm23 基因是重要的转移抑制基因,编码M r17 000的蛋白,具有抑制肿瘤转移的功能。研究表明,nm23 在分化良好的肿瘤中呈高水平表达,且表达与淋巴结转移呈负相关,与无肿瘤生存期,整个生存期呈正相关。nm23 已在胃癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、骨肉癌等具有转移潜能的肿瘤细胞中呈低表达,在乳腺癌,大肠癌中nm23 表达水平与肿瘤状态和转移距离远近有关。 检测nm23 表达水平作为判断肿瘤有无转移,对临床治疗具有指导意义。检出nm23 的临床意义:(1)正常人血中检出nm23 ,预示可能存在肿瘤。(2)发现肿瘤后,若检出nm23 ,预示肿瘤转移。(3)术后患者检出nm23 ,预后差。

7. 黑色素瘤-PCR 黑色素瘤基因是人类恶性黑色素瘤的特异抗原基因,一旦检出此基因,就表明有恶性黑色素瘤存在,对恶性黑色素瘤的诊断有特异性。

8. 乳腺癌-PCR 乳腺癌基因是由乳腺癌基因1与乳腺癌基因2组成,对乳腺癌诊断具有特异性,其检出符合率达85%左右。因此,检测乳腺癌基因,对乳腺癌普查和诊断具有重要意义。

9. 胃癌-PCR 胃癌特异基因是从胃癌cDNA文库中筛出的高表达基因,通过对此基因表达程度的检测,可判断有无胃癌发生。 K-ras、H-ras、C-myc mRNA 的表达可作为胃癌早期诊断参考指标[18] 。

10. 肝癌-PCR 临床常检测血中AFP含量来判断有无肝癌发生,但是仅凭AFP含量很难早期诊断肝癌,通过对外周血AFP mRNA含量的检测,既可以早期诊断肝癌,又可判断肝癌治疗的效果,是目前诊断肝癌预后的重要的分子生物学指标。 Ras、 p53 基因及其蛋白表达与原发性肝细胞癌转移相关 [7] 。

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