原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录

一、仪器设备

英国Thermo Hybaid原位PCR仪。

二、操作流程

（一）原位PCR步骤

1、预处理：　　（1）切片常规脱蜡；　　（2）0.2mol/L HCl处理10min；　　（3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；　　（4）Nase消化组织37℃ 30min；　　（5）梯度酒精脱水，室温干燥。

2、原位扩增：　　（1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；　　（2）PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30个循环，72℃延伸10min；　　（3）氯仿洗去盖玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。

3、原位杂交：　　（1）加地高辛标记探针的杂交液，98℃变性10min，-20℃退火5min，42℃杂交过夜。　　（2）杂交后用2×SSC洗涤10min，3次，1×SSC洗涤10min，3次；　　（3）缓冲液洗涤10min，3次；　　（4）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h；　　（5）缓冲液洗涤5min，3次；　　（6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。　　（7）常规脱水：透明、封固。

（二）原位RT-PCR步骤

1、预处理：　　（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸馏水洗；　　（2）95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。

2、原位扩增：　　（1）在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；　　（2）用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min。再将热循环仪设定为95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循环；　　（3）扩增结束后，在80℃烤15min～30min。

3、原位杂交：　　（1）杂交前标本95℃加热3min；　　（2）加上杂交液，湿盒内50℃过夜；杂交液组成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA， 每0．5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。　　（3）扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。