双向电泳的实验过程

一、        实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 二、        实验步骤： 1. 样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，―80oC保存。 2. Bradford法测蛋白含量 取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。     取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：     编号        蛋白量（ul）        Buffer(ul)        Bradford(ml)        OD595值 1        0        80        4        0 2        5        75        4        0.024 3        10        70        4        0.061 4        15        65        4        0.091 5        20        60        4        0.116 Bt4        2        78        4        0.079 Bt4        4        76        4        转Bt4        2        78        4        0.075 转Bt4        4        76        4          标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知      相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得 OD值测量过程： 比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。 3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水） 3.1 水化液的制备 称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。     在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，        振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。    3.2 点样，上胶         分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline  DryStrip gels (18cm，pH 3―10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。    3.3  IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20oC）        S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)        S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)    S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step) S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad) S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共计44110vhs, 19.5小时 其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦 3.4 平衡     用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。  注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。      平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS―PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。 4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE   4.1 配胶(两根胶条所用剂量)    分离胶：（T=8%  80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED            30 % 丙烯酰胺储液    21.28ml            分离胶buffer          20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul            双蒸水               38.72ml    浓缩胶：（T=4.8%   10ml）            30 % 丙烯酰胺储液    1.6ml            浓缩胶buffer          2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul            双蒸水               5.9ml   4.2 灌胶       将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。   4.3 转移       剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS―PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS―PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。 4.4 跑胶      浓缩胶  13mA         分离胶  20mA        共约5.5个小时 5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水） 5.1  固定   30min    无水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超纯水定容至500ml 5.2  敏化   30min    无水乙醇 150ml                       Na2S2O3•5H2O  1.5688g                       无水乙酸钠          34g                         先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml 5.3  洗涤   5min  ×  3次 5.4  银染   20min     AgNO3   1.25g   用超纯水定容至500ml 5.5  洗涤   1min  ×  2次 5.6  显影             无水Na2CO3    12.5g   用超纯水定容至500ml                    甲醛(37%)0.1ml, 临时加 5.7  终止   10min     EDTA―Na2•2H2O  7.3g  用超纯水定容至500ml 5.8  洗涤   5min  ×  3次 注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。