各类western转膜条件

除了抗体原因，转膜恐怕是western blot成败的最关键因素。

园子里好多好多人在求助转膜时间，因此我们总结了一系列分子量蛋白转膜的时间，希望对大家有用。 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白 蛋白名称（可保密）：一些转录因子 蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞 总蛋白 蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压 100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“Bio-Rad mini”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织 总蛋白和核蛋白 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理） 转膜方式（恒压、恒流）：半干转 恒压 12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“Bio-Rad mini” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压 90 V-110 V，控制电流不要超过300 mA。 转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本 蛋白名称（可保密）：转录因子 蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转 Bio-Rad 说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。 蛋白来源：成纤维细胞 蛋白名称（可保密）：smad3 蛋白分子量：54 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转 Bio-Rad 蛋白来源：胰腺癌细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：120 V 恒压 转膜时间：90 min 转膜设备：湿转 Bio-Rad 蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：72 KD，42 KD 和22 KD WB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜0.26 A，两张膜0.3 A。 转膜时间：90 min 设备：“Bio-Rad mini” 建议：转膜缓冲液最多用3次，最好现用现配，我们用的没有加SDS，转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温，这样转的效果要好一些，转的时候一定要把三明治每层之间的气泡除去，同时使滤纸大于膜，膜大于胶，以免烧坏电极。 蛋白来源：大鼠PBMC 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：55 KD WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜 转膜方式（恒流）：湿转 转膜时间：60-90 min 设备：“Bio-Rad mini” 建议：转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了 其它按照常规就好了 其实0.22的膜一般不怕转过头 以我们的经验，转膜时间、电压其实也有很大范围的调整 ，并不是非要固定于哪一个最合适，曾经做过 一张膜转，17 KD的和170 KD的，按照170 KD的条件，17 KD的转膜也很好的。 蛋白来源：人非小细胞肺癌细胞系 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：大于250 kD WB用膜类型、孔径：millipore PVDF膜 0.45 um 转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流0.3A。 转膜时间：180min 设备：“Bio-Rad ” 建议：电转保持电压在70 V以上，保持低温，如果电压低过70就需要换缓冲液了。

蛋白来源：白血病细胞 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：28 KD WB用膜类型、孔径：0.45的NC膜 转膜方式（恒流）：湿转，90 min，0.25 A 设备：“Bio-Rad ” 建议：海绵厚度要合适，一次转磨用的海绵太薄，导致三明治没夹紧，转膜后拿出来一看，marker都变得七扭八歪。但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断，没经历过，不知道是不是会有这种情况。 蛋白来源：肿瘤细胞 蛋白名称（可保密）：磷酸化蛋白 蛋白分子量：10-200 KDa WB用膜类型、孔径：millipore PVDF膜 0.45 um 转膜方式（恒压、恒流）：120 v 恒压 转膜时间：120 min 转膜设备：湿转 Bio-Rad

建议：转膜缓冲液只用2次，基本都转上，5%BSA封闭，减少背景。

蛋白来源：胰腺β细胞 蛋白名称（可保密）：****** 蛋白分子量：90-130 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：250 mA 恒流 转膜时间：150 min

转膜设备：湿转

蛋白来源：原核表达 蛋白名称（可保密）：保密 蛋白分子量：38 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压：100 V

转膜时间：120 min

蛋白来源：心脏 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：220 kDa，130 kDa，70 kDa，41kDa WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：70 v120 min，180 min，5-6 h 转膜设备：伯乐湿转 建议改进方向（可选）：40 kDa一下，70 v ，60-90 min足够，40-70 kDa 90-120 min即可。

70-120 kDa ，70 v，120-180 min足够，120-180 kDa ，180-240 min，180 kDa以上建议6 h。

蛋白来源：卵巢癌细胞膜蛋白 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：53 KD WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45 um 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：80 V 100 min

转膜设备：湿转 Bio-Rad

蛋白来源：人宫颈癌HELA细胞总蛋白 蛋白名称（可保密）：β-actin 蛋白分子量：42 WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45 um 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：50 4 h 转膜设备：湿转 Bio-Rad 蛋白来源：脑组织 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KD、27 KD、32 KD、42 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22 um 转膜方式（恒压、恒流）：半干转 恒流 1 mA/cm2或2 mA/cm2 转膜时间：不定 转膜设备：北京六一仪器 建议：我共做了六个蛋白，所以总在想节约时间的方式。

在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系，所以我不会按时间来定何时转完，而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了，不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多，效率也会下降，所以时间和转膜效率（尤其是使用后期）的关系并不稳定，单纯依靠时间有时会有问题。

蛋白来源：CHO cell 蛋白名称（可保密）：酶原 蛋白分子量：40 KD WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜（Biorad） 转膜方式（恒压）：100 V，湿转，转膜时间：60 min。 设备：Tanon（上海天能） 建议： 1. 转膜液现用现配，用完倒掉。

2. 转膜时间，电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白，采用此条件一样转膜效率很高。

蛋白来源：Hepg2 蛋白名称（可保密）：EGFR 蛋白分子量：170kd WB用膜类型、孔径：pvdf 0.45 转膜方式（恒压、恒流）：24V 转膜时间：2个半小时 转膜设备：伯乐半干转 蛋白来源：肝癌细胞 蛋白名称：HIF-1α 蛋白分子量：120 kD WB用膜类型、孔径：NC膜 转膜方式（恒压）：80伏，湿转 转膜时间：150分钟 设备：“Bio-Rad mini”

建议：湿转，转膜液特别重要，否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用，不重复利用。转膜时间一般是150分钟，80伏恒压。经李春红染色，靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深，膜另外一面染色浅，说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围：170-36 kD。

蛋白来源：心肌细胞总和膜 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：128 KD，100，60，55，43 KD WB用膜类型、孔径：NC膜 0.2 um 转膜方式（恒压、恒流）：恒压 转膜时间：70 V 200 min 转膜设备：湿转 Bio-Rad 建议：转膜液最好现配现现用，或配成母液，最好不重复使用，70 V电压下，电流约154 mA。甲醇可以加到150 ml。对大分子量如200 KD转膜时间延长6-8 h。