Western Blot 中的新技术、新仪器

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1981 年美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)发明了蛋白质印迹(western blot )。但是接下来二十多年的时间，Western blot 的步骤一直都没有什么大的改变，大家还是沿用分子克隆上的技术和试剂。直到近几年，一些新技术新产品的不断涌现，使得Western blot 的实验效率和结果的准确性都得了大大提高。现在Westernblot 中高灵敏度的化学发光检测、准确定量蛋白、自动化操作和CCD 成像系统已经非常普及，目前的发展趋势是多通道荧光检测。广大科研工作者一直以来可能关注试剂比较多，不过下面提到的这些新仪器新技术，让Western blot 发生了革命性的变化。

传统western blot 存在的问题

western blot 的原理非常简单，但是过程繁杂漫长的让人无法忍受，制胶1-2hr，电泳1-2hr、转膜1hr-过夜、封闭1hr、一抗1hr，二抗0.5-1hr，暗房压片显色0.5-1hr，然后胶片扫描图像分析。就算是熟手整个过程做完也要两天时间。即使是这么辛苦，也未必能拿到想要的结果，那么问题到底在哪儿那?我们分步剖析一下传统western blot的过程及其存在的问题：

1，制胶：凝胶聚合不完全，漏胶等问题都会影响电泳的分离，进而影响结果。

2，电泳：电泳过程中只能看到预染marker 的电泳情况，但是却看不到样品的真实情况。如果蛋白样品降解，电泳行为异常，我都不会看到，等到结果出了问题以后，找原因又无从找起。,

3，转膜：转膜结束后无法看到样品转膜的真实情况，如果要观察，则胶需要染色脱色。膜上检测也能用只能丽春红染色定性，大致看一下。无法计算每个样品的转膜效率是否一致。

4，暗房压片：胶片检测的线性范围只有1.8OD，对与表达量差异大的样品无法确切定量。压片时间也需要优化，可能需要反复摸索，对与一些稳定性比较差的试剂，可能会出现条件还没摸索好，光就淬灭了。

5，多蛋白检测：如果想在一次实验中完成对多种目标蛋白质的检测，则需要复杂的剪膜(cutting the blot)、顺序检测(sequentially detecting)、stripping 和re-probing 等方法来操作，这些方法都会对结果的准确性产生影响。

由于存在这些问题，常常会发生科研人员辛辛苦苦做了两天的实验，却拿不到想要的结果，但是又找不到问题出在哪里?导致一些科研人员对western blot 实验深恶痛绝。

近些年来，随着新技术和出现和新仪器的使用，传统western blot 实验所存在的问题也逐渐的得到了解决。

下面我们逐一介绍一下这些新的技术和仪器。

Stain Free 免染技术

Stain Free 免染技术源于2002 年发表在《Analytical Biochemistry》上的一篇文章。文中指出聚丙烯酰胺中的蛋白可以进行快速检测。方法是将蛋白胶浸泡在三氯乙酸或氯仿中，然后通过紫外光照射。在三氯化合物存在时，紫外光会驱使色氨酸发生反应，产物会发出可见区内的光，从而实现蛋白条带在胶上的定位。Bio-Rad 公司利用了这项技术，并在其基础上进行了二次研发，开发出了Stain Free 免染技术。

Stain Free 免染技术主要包括两个部分：Stain Free 免染胶，和Chemi Doc MP 全能成像系统。当然，为了分析结果，你还需要电脑和Image Lab 软件。Stain Free 免染胶与普通的预制胶可不同，含有专利的免染技术在里面，所以不能拿平时用的预制胶来代替。样品制备及电泳步骤与普通的电泳一样。电泳之后，取出凝胶，放置在Chemi DocMP 全能成像系统中。分离的蛋白通过特定波长的UV 照射而激活，产生荧光，从而被CCD 照相机捕获。1-2 分钟左右，蛋白的图像就出来了，Image Lab 软件还会根据蛋白Marker，自动估算每个蛋白条带的分子量和数量，超级省心。

你看，完全用不着染料，也不需要等待，电泳完几分钟图像就出来了。现在体会到科学技术是第一生产力了吧。

Stain Free免染技术的特点：

1,快速

这个自不必说，与一般的考马斯蓝染色相比，起码省了两个小时。对于一个熟练的科研人员来讲，平常染色1小时，脱色半小时，还要洗啊、拍照、分析，至少也要2 个多小时吧。如果是一个生手，可能要折腾个一两天，最后拿到的图片可能还是惨目忍睹。现在好了，即使你是一个第一次跑胶的超级菜鸟，没有任何的经验，你也只需要最多5 分钟就搞定了，连分析都替你包办了，直接出来一张分析报告，包括凝胶图像、分子量和纯度分析。而且系统中用的是预制胶，最烦人的配胶、等胶的时间也省了，即开即用。在快毕业或急着发文章的时候，这一点尤其重要。

2,重复性好

有时候染色、脱色的时间不同，产生的胶图也会相去甚远。这里多一条带，那里少一条带，没办法进行比较。Criterion 就不同，分析标准化，数据之间容易进行比较。另外一点还是要归功于预制胶。预制胶虽然贵点，可还是贵的有道理。毕竟是工业化生产的，跟我们手工配制的就是不一样，而且有时候试剂放太久了，配出来的胶其实就是不合格的，结果当然不会漂亮。

3，操作极为简便

Chemi Doc MP 成像系统加Image Lab 软件，使用非常方便，无需手动调节焦距，光圈，曝光时间等参数。只需要你选择样品类型，放置好凝胶，成像系统就会自动的帮你拍到一张最优化的图像。功能强大且操作极为简单的中文软件可以让你轻松的在几分钟之内完成分子量计算、定量计算、纯度分析等多种分析操作。分析结果可以直接用于文章发表，还可以直接输出多种格式的杂志要求分辨率的图像。

4,环保

整个过程中，你再也无需和有毒的试剂如丙烯酰胺、甲醇等打交道，也不会产生有机污染物，更加环保。环保最重要的就是保护自己，丙烯酰胺、甲醇等试剂虽然是剧毒的药品，但是毒性的发作却是慢性的，做完实验不会马上感觉到，但是日积月累将会对你的身体带来巨大的伤害。

5，灵敏

灵敏度是大家最关心的问题。如果灵敏度不够，再简便省时也是白搭。事实证明，Stain Free 免染胶的灵敏度比考马斯蓝染料更高。而通过对一系列蛋白标准品进行LOD(检测极限)和LOQ(定量极限)分析，Stain Free 免染胶表现更好，具体的分析步骤和结果请查看Bio-Rad 公司的技术札记(Bulletin_5782)。

从2 小时到2.5 分钟，Stain Free 免染技术彻底颠覆了传统的蛋白凝胶分析流程，让我们更轻松地获得更准确的结果。

快速可靠的电泳技术：

传统的手灌胶不但耗费时间，而且质量难以把控，不同胶之间的重复性很差，预制胶的出现是这些难题迎刃而解。

由于Laemmli 系统能够分离来源于不同缓冲液体系的众多复杂样品，其被公认为SDS-PAGE 技术的金标准。而传统的Laemmli 系统的缺点在于凝胶基质的稳定性随着时间推移而降低，所以手工制作的凝胶必须要随用随制。而商业化的Laemmli 系统的预制胶通常只有几个月的保质期，而且随着时间的推移凝胶的品质不断地降低。

新的Mini-PROTEAN TGX (Tris-Glycine eXtended)预制胶PAGE 基于对Laemmli 系统的新型改良从而能够显著地增加凝胶基质的稳定性。TGX 凝胶用标准样品和Tris/Glycine/SDS 电泳缓冲液并保留了类似Laemmli 的分离特性。

这种改良使凝胶拥有了超过12 个月的保质期并且结果的重现性极好。说到快，新的Mini-PROTEAN TGX (Tris-Glycine eXtended)预制胶的电泳速度快到让人不可思议，一块小胶15

分钟就可以完成电泳过程。将原来的制胶和电泳过程由3 个小时以上缩短到15 分钟，而且分离效果和重复性大大提高，应该算是一个革命性的技术了。

让人不可思议的快速转印技术做western blot 实验的人都知道转膜也是一个耗时的工作，根据目的蛋白样品不同，转膜时间从半小时到过夜不等。如果现在告诉你有一种转膜方法，只需要3 分钟，你是不是会惊叹道“天哪，这是不是在开玩笑?之前配转印buffer 都不止3 分钟，现在竟然连转印都完成了”我们不得不感慨科技进步之快，全能型蛋白转印系统Trans-Blot Turbo ，就可以将转印时间缩短至3 分钟。

全能型蛋白转印系统(Trans-Blot Turbo)是一款集速度、便利性和重复性于一体，能够提供比其他现有方法更快的结果的改良版半干转印系统。这个半干式系统采用了一种新配方的转印缓冲液，并使用了一种特殊材质的滤纸。

这种组合能够承受更大电流，使转印不仅更快，而且更完全。整个转印过程只需要7 分钟即可完成，如果选用TGX预制胶，实验时间更可缩短至3 分钟。

Trans-Blot Turbo 包含两个cassette，每个cassette 可容纳1-2 块mini 胶或1 块midi 胶。这两个cassette 是独立控制的，你可以先转一个，再去装配另一个，非常方便。Trans-Blot Turbo 还有着灵活的设计。你可以选择预设程序帮助指导实验设计，并可根据实际需要人为修改程序并存储调用。转印过程可在无人照看下自动运行。同时，Trans-Blot Turbo 系统还可以兼容传统的实验耗材，真正实现了实验方法的灵活性。

Trans-Blot Turbo 使用起来也相当便捷。即用型的转印耗材包Turbo Pack 避免了准备缓冲液和膜的需要。转印耗材包中带有PVDF 膜或NC 膜，有mini 和midi 两种规格。

高灵敏度的全能型成像技术

随着技术的快速发展，成像系统成本越来越低，因而在现在的实验室里使用冷CCD 成像系统来用于western blot实验中的化学发光成像已是越来越普遍。目前几乎所有Western blot 的新技术都是针对CCD 成像系统的，它代替了传统的胶片成像。胶片成像虽然灵敏度很高，但也有很多缺点：耗时，需要暗房和显影剂，胶片很贵，而且是一个消耗品，需要持续购买。另外，检测线性范围很低，用胶片上的蛋白条带进行定量几乎是“不可能的任务”，和目测一块考马斯蓝染的胶没什么区别。冷却型CCD 照相机与X 胶片相比具有瞬时影像处理、高灵敏度、高分辨率、动力学范围广等优点，而且还不需要胶片处理装置及暗室。然而，这项技术要求底物能产生高强度长持续时间的信号，以被照相机捕获到。不过这个也不是问题，Bio-Rad 公司开发了信号能持续24 小时的Western blot 试剂盒Western C kit，而且灵敏度超高，达到了飞克级别。

现在90%以上的研究者们Western blot 要检测的都是两个或以上的蛋白，因为除了目的蛋白之外还必须要有一个内参蛋白。多色的荧光Western blot 可以满足研究者对于多蛋白分析的要求，使我们可以检测到电泳中重叠的蛋白条带，如果我们用传统的化学发光方法，是无法将它们分开的。即使是对于分的很开的不同的条带使用化学发光检测也是很不方便，需要做复杂的剪膜(cutting the blot)、顺序检测(sequentially detecting)、stripping 和re-probing等方法，且结果也不能保证。

多色荧光检测则可以省掉这些步骤，通过一次成像就可以完成多个蛋白的检测，且相互之间没有影响，有效的解决了这个问题。

说到成像，连续七年获得生命科学产业成像分析系统大奖的Bio-Rad 公司在这方面当然是技高一筹。它的Chemi Doc MP 成像系统采用Peltier 冷却的高分辨率数字CCD 技术，并结合了独特的宽波长紫外激发光源及高效的光学设计，能提供目前最高的检测灵敏度、均一性、灵活性及动态范围，在性能表现上可与更昂贵的以激光为基础的技术相媲美。

全能型成像系统ChemiDoc MP 是一台集普通成像、化学发光成像、多通道荧光成像和Stain Free 免染技术于一体的全能型成像系统。其优越性主要表现在以下几个方面：

超好的灵敏度

Chemi Doc XRS+ 作为目前化学发光成像系统领域的绝对领导者，其性能被大家一致认可。Chemi Doc MP 在其基础上对核心部件进行了升级，使得Chemi Doc MP 的性能远远超过前者。由于采用了最高端的CCD，ChemiDoc MP提供了最好的化学发光检测灵敏度，和最高的荧光检测灵敏度。同时在检测的线性动态范围上要比film 高出很多(4O.D. vs 1.8 O.D.)，也节省了很多film 所必须的暗室、冲片机等设备。

杰出的图像质量

ChemiDoc MP 系统在提供高灵敏度的同时自动产生可供发表的高质量图像，最大分辨率可达1200dpi。即使将结果放大数十倍，客户依然可放心的用于发表文章、讲座演示、会议讨论等。

无可匹敌的应用广泛性

ChemiDoc MP 系统是一台真正的全能型的成像系统，它可以适应客户多种不同的应用要求。从多通道荧光检测、化学发光检测到普通凝胶成像，ChemiDoc MP 可以解决从凝胶检测到膜检测的多种不同应用。

希望在一个样品中检测不止一种目标蛋白质的客户。使用ChemiDoc MP 的RGB、Chemi 和Stain-Free 检测功能，客户可以方便的在一次实验中完成对多种目标蛋白质的检测。而无需再去做复杂的剪膜(cutting the blot)、顺序检测(sequentially detecting)、stripping 和re-probing 等方法，且结果更加准确。

此外，作为一款全能成像系统，其预留的光源接口方便您将仪器升级到红外成像等功能。

系统操作简单快捷

Image Lab 4.0 软件可以进行多通道荧光成像设置，用户只需要选择通路(channel)和应用(application)，软件就会自动为您选定最合适的滤光片、激发光源和曝光设定，同时全程保持自动对焦。

软件可在中英文版之间自由转换，新手无需培训就可轻松掌握。图像处理及分析无需再用复杂的PS，Image Lab软件将提供众多的分析功能以满足您的实验需求，且操作极为简单，其易用性超过美图秀秀。

内置Stain-Free免染功能

作为Bio-Rad V3 Western Workflow 的一部分，ChemiDoc MP 内置的Stain-Free 免染技术，使客户可以在Western实验流程的不同阶段都进行校验，从而确保实验结果的可靠性。

此外，ChemiDoc MP 还可以配合Stain-Free 免染技术方便的进行Total protein 的Loading control 检测，使Western 的定量变化检测更加准确，避免了使用单一看家蛋白(housekeeping protein)带来的误差，并且省时、省力、节省抗体。

总结

说到这里我们再回头看一下传统western blot 中的存在的问题是不都都已经被这些新技术，新仪器解决了。结果自然是不言而喻，新技术和新仪器的出现使得Western blot 变得更加快速、高效和准确。

这么多年来，Western blot 一直是我们研究蛋白的基本工具。借助于不断涌现的新技术，Western blot 已经从定性发展到定量，从自然发光发展到化学发光到荧光，从一次只能检测单个目标发展到一次可以检测多个目标。期待更多杰出技术的出现，让Western blot 更高、更快、更强!