Northern杂交实验指导之四：模板DNA制备

Northern Blotting技术专题

A.质粒 DNA的小量提取

试剂及其配制

含AP的LB液体培养基

TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)

1mmol/L EDTA (pH 8.0)

溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)

10mmol/L EDTA

50mmol/L 葡萄糖

高压灭菌15min.后，4℃贮存。

溶液II: 0.2mol/L NaOH

1% SDS(临用前现配制)

溶液III(100ml)：5mol/L 乙酸钾 60ml

冰乙酸 11.5ml

dH2O 28.5ml

4℃贮存。

酚∶氯仿(1∶1)

95%和70%乙醇

试验程序

1.在纯净工作台上将5ml含AP的LB液体培养基加入到一10~15ml通气良好的试管中，然后将前述经鉴定含有目的DNA片断的转化细菌 接种其中，37℃下振荡培养过夜。

2.取1.5ml培养物置于一微量离心管中，在4℃下12000rpm离心2min.，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。

3.将细菌沉淀重悬于100μl溶液I中，剧烈振荡后加入200μl新配制的溶液II，盖紧离心管口，将其快速颠倒5次(切勿振荡)，再加入150μl在冰上预冷的溶液III，盖紧离心管口，将其倒置后轻轻地振荡使溶液III在粘稠的裂解物中分散均匀，再将离心管置于冰上3~5min.。

4.在4℃下12000rpm离心5min.，将上清液移至另一离心管中。

5.加入等量酚∶氯仿(1∶1)，振荡混匀，在4℃下12000rpm离心2min.，将上清液转入另一离心管中。

6.加入二倍体积95%乙醇，振荡混匀，室温放置20min.，在4℃下12000rpm离心5min.，小心弃去上清液，倒置将液滴除尽。

7.用70%乙醇洗涤一次，室温干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶(无DNA酶)的TE重新溶解质粒DNA，取1μl 在含溴化乙锭的微型胶上进行电泳检测，其余置于-20℃保存备用。

B. 质粒DNA的线性化

试剂及其配制

Not I和Sal I内切酶及其相应的缓冲液

酚∶氯仿(1∶1)

3mol/L NaAc(pH 5.2)

100%和70% 乙醇

DEPC-H2O

试验程序

1.在离心管中依次加入：质粒DNA 10μl (1μg/μl)

10×内切酶缓冲液 10μl

dH2O 80μl

Sal I或Not I 2μl(10U/μl)

2.37℃保温反应2小时以上。

3.消化液用100μl的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm离心5min.

4.将上清液转入一新的离心管中，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇沉淀过夜。

5.4℃下12000rpm离心20min.，弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤一次，真空干燥。

6.线性化质粒DNA按0.25μg/μl的浓度重悬于DEPC-H2O中，取10μl电泳检测线性化质量，其余于-20℃下保存备用。