Northern blotting步骤

Northern Blotting技术专题

1. 取RNA

2. 将电泳槽 和板，梳齿浸泡在3%H2O2中20-30分钟，并吹干

3. 跑1%琼脂 糖凝胶，检测样本RNA含量

4. 变性胶

在桌面上利用保险膜铺出一块干净的区域，将1.95g 琼脂糖加入110ml 的 DEPC-H2O (加热前可在三角瓶上做一个记号，在加热后把蒸发的水分补足)加热沸腾，冷却(补水)至60度左右。加入15ml 10xMOPS (PH8.0)和25ml 甲醛，混匀后倒胶，冷却待用。

5.电泳液(1L)

100ml 10xMOPS (PH7.0)

800ml DEPC-H2O

100ml 甲醛

6.sample buffer(-70度保存)

1650 μl 体系：

200μl 10xMOPS (PH8.0)

350μl 甲醛

1ml 甲酰胺

100μl loading buffer(DNA用染料)

用枪吹吸混匀

以样品RNA : sample buffer= 1:3 (v:v) 的比例加入 (RNA marker 同样)

点样前 68℃ 5分钟(RNA marker 同样)

7.跑电泳

120-150V，大约4-6小时(跑到整块胶还剩下1/3)每半个小时吸一次阳极的电泳液到阴极(平衡酸碱性)，将胶切下。如加RNA marker 则用EB染5’，洗20’，将胶切去一个角作为位置记号。

8.转膜

转膜液： 20xSSC:

1000ml体系：

175.3g NaCl

88.2g 柠檬酸纳

NaOH 调节到PH7.0

定容

搭建盐桥：将20XSSC倒入白磁盘中，上担一块玻璃板，用一张大滤纸，两边浸入白盘中SSC，注意：防止短路，接触面不能有气泡，上反放胶，覆与胶等大的尼龙膜，再覆等大的滤纸，再压上一叠吸水纸，压上重物。

9.压膜16h以上，期间要换吸水纸。紫外交联2’。7XSSC洗15’。用滤纸包膜，以培养皿压住。

10.烘膜

80℃ 2h

旧膜以煮沸的洗膜液洗脱两次，10’每次轻柔震荡。

11.预杂交

先用水冲洗杂交管，再用洗膜液冲洗。

加5ML 预杂交液(杂交液没过膜即可)于杂交管中，将膜小心放入用杂交液将膜浸润，使其贴在管壁上，不可有气泡，有DNA的一面朝向管内，放入杂交炉中55度转3hr以上，(旧膜半小时)

12. 探针 标记

1】做柱子

用烧红的针头将0.5ml的离心管底部戳一个小洞，加入玻璃纤维将开口堵住，入Sephadex G50 3000rpm 5’，待液体流尽后，加入TE洗涤三次(3000rpm 5’)。

2】标探针

在离心管中加入探针约2ul(20-70ng, 太多会竞争性吸收同位素)，

oligo(kit1) 2μl

buffer(kit2) 2.5μl，

双蒸水12.5μl，

100℃ 5’，0℃ 5’

再加入dNTP(kit4) 2.5μl.

Klenow 1μl

双蒸水6ul

-p32-dCTP 1.5μl,

37℃水浴 20-30’

加入TE 100μl，过柱纯化，套上大1.5ML 安培管，3000 rpm 3-5min , 再加入100μl TE 洗柱子3000 rpm 3min, 加入4μl 6N NaOH 室温变性5min(可先将NaOH加入管中)

5.杂交

将探针加入杂交管中(注意不要加在膜上)65℃杂交过夜(大于16小时)，膜不能干掉。

6.洗膜

室温下用少量洗膜液洗涤杂交膜3-5min，注意回收放射性洗液，倒入洗膜液，65℃ 10min 回收洗液，用放射性计数器测一下放射强度，视放射强度，然后重复1-2次。

7.压磷屏

用保鲜膜将膜包好(液体要吸干)，压磷屏20hr左右，扫描观察。