western blot试验心得

前两天做了一个western blot,现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！ 1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。 2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜，不要漏掉任何一个小角落哟。 3 洗膜的时候，最好将膜放在平皿中，置于水平的试验桌面上，不时用手晃动一下平皿，这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。因为在脱色摇床上晃动，有时洗涤液不足以完全没过膜，在最后显色的时候，会发现液体流过的一道道痕迹，使背景值增加。 4 其实在western blot中，以上操作都是小问题，最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。在试验之前，最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测（如ELISA），看看其效价和质量，以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。另外，在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶，染色，检测一下待检蛋白的提取质量。 5 在加一抗温育之前，最好先将等量的一抗与野生型（即阴性对照）的蛋白在37摄氏度作用30分钟，这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。 6 一定不要忘记做阴性对照和阳性对照，特别是阴性对照，不然结果出了什么问题，就无从分析了。 7 全程做下来，最后的显色就像是个一锤定音的时刻，分外激动，但也应该尤为专注，一旦目的条带出现了，就要马上对显色进行终止，要不然杂带就要出来了。