蛋白质转印法

蛋白质经SDS-PAGE后，胶片浸入转印缓冲液，蛋白质可被转印到硝化纤维纸（nitrocellulose） 上，先经尿素洗去SDS,并使蛋白质回复原态抗原性，可使用抗体进行免疫染色 （Towbin et al, 1979）。

仪器用具：

电泳转印槽 （Hoefer Transphor TE 52）：转印槽 （可容纳4 个转印三明治）转印三明治 （转印夹、方形海绵垫2 片）转印纸：早期使用硝化纤维纸，现在多用尼龙材质者Immobilon P （Millipore IPUH 000 10, 0.45 μm, PVDF 材质）滤纸 （Whatman #1, 3MM） 两张，裁成比转印纸稍大者。供电器 （可供400~500 mA者）方形培养皿 （转印纸清洗用）旋转摇荡器 （rotary shaker）

药品试剂：

转印缓冲液 （Blotting buffer）：10×溶液

Tris （Tris base, 25 mM×10） 60.6 gm

甘胺酸 （0.192 M×10） 288 gm加水1,500 mL 溶的，pH 以HCl 调到8.3,加水至 2,000 mL 使用时取500 mL 倒入一5 L 桶中，加500 mL 甲醇后，加水到5 L,均匀搅拌的。 如此配成者，含10%甲醇；若是转印胜或是蛋白质的分子量太小，可提高到20%.

甲醇 （用来润湿尼龙材质的转印纸）

PBST 洗液：PBST 为pH 7.0 的PBS （phosphate buffered saline） 缓冲液，另加有0.05%Tween-20,用来清洗转印纸，以去除非专一性的蛋白质吸附。

尿素洗液 （6M Urea-PBST） :尿素180 gm 溶在300 mL PBST 中，加温搅拌溶解，再加PBST 至500 mL.

方法步骤：

◆ 全程请戴手套操作，以免污染转印纸！

1） 电泳后SDS-PAGE 胶片浸在转印缓冲液中，洗2~3 次，每次10 min.

2） 取出转印槽，先小心放一搅拌子在底部，再倒一半转印缓冲液。

◆ 搅拌子千万不能丢到转印槽内，会打破转印槽底部的陶瓷散热片。

3） 取转印纸切成约如胶片大小，先在方形培养皿中以少许甲醇浸湿数秒钟，再置入转印槽中的缓冲液10 min 后使用。 另取两张滤纸，以及两片方形海绵垫，都放在转印槽的缓冲液中备用。

4） 取出转印夹打开平放，先垫一张方形海棉垫，铺上一张湿滤纸，小心迭上已润湿的转印纸，其间勿陷入气泡；转印纸再滴上数滴缓冲液后，小心平铺胶片上去，加盖一层滤纸，及另一张海绵，也都不可陷入气泡，即可把整个转印三明治卡夹装好。

◆ 胶片迭到转印纸时，最好一次成功，不要重作，否则蛋白质色带可能会印上去，最后产生重迭影像。

5） 将转印三明治置入已经放有一半转印缓冲液的转印槽中，注意有转印纸的那一面向正极 （红色），胶片那面向负极 （黑色）。

6） 当三明治都放入转印槽后，以转印缓冲液盖满所有的三明治，小心动一动卡夹，除去附在卡夹内外的气泡，盖上盖子，放到一搅拌器上，打开搅拌器开始搅拌，同时接好电源，装置完成后放置10 min.

7） 以400 mA 开始转印，温度会渐渐上升，转印1.5 h 后中止转印，取出转印三明治，打开后依次取出转印纸及胶片。

◆ 上述转印条件会使温度上升至70~90℃，若有冷却系统，可把温度控制设在5℃；转印槽内应该加以搅拌，以便使整个温度分布均匀。

8） 转印后的胶片可以继续进行CBR 染色，看有无蛋白质残留。 若电泳时加有蓝色标准蛋白质marker （SeeBlue），则可在转印纸上看到蓝色的色带，确定转印成功，并可评估转印效率。

9） 转印纸浸在约15 mL 尿素洗液中浸洗过夜，期间换三次尿素洗液，并且要温和摇荡的。

10） 若不做免疫染色，则转印后不用尿素洗液清洗，以清水冲过后改用amido black （l %溶于10%甲酸） 染色1 h,再以10%甲酸脱色，冲水后晾干即可，但其灵敏度较低。