BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析法

一、原理 BCR蛋白分析是一种对样品中总蛋白进行量化的分析方法，原理是在碱性溶液中蛋白质可以将Cu2+还原成Cu1+（双缩脲反应），从而出现明显的紫色，铜离子被还原主要是蛋白质分子中半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸，色氨酸四种氨基酸的作用，然而，与Coomassie燃料结合反应不同的是，一般的多肽键都能形成颜色，从而减少了由于蛋白质不同的变异性。 与Bradford分析实验相比较，BCA实验分析更加客观，普通的肽键就能出现颜色反应，其弊端是其反应容易被蛋白质样品中的某些化学物质干扰，包括还原剂（二硫苏糖醇和硫基乙醇等），铜离子螯合剂（EDTA,EGTA）和高浓度缓冲液，但是这些干扰作用可以通过对蛋白质样品的稀释进行消除。 二、材料与试剂

1. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma）

2. BCA蛋白检测试剂（Pierce）

三、仪器

1. 分光光度计（Tecan）

四、操作步骤

1. 制备BSA标准样。先配制1 ml BSA母液（2 mg/ml，溶于水中），再配制浓度在20-2000 ug/ml 的一系列（5~8）稀释液。

2. 准备BCA工作液（WR）。计算所需工作液的总体积。WR是将BCA试剂A和BCA试剂B按50：1的比例混合（混合液是绿色澄清溶液）。

3. 若在测量管中测定,每个样品需要2.0 ml WR。样品与WR的比例为1：20。

4. 各吸取0.1 ml 标准样和未知蛋白样品，加入标记号的测量管中。设两个一样的空白对照管，一个用于标准曲线，加入0.1 ml H2O来代替BSA。另一个用于蛋白样品，加入0.1 ml 蛋白提取液。

5. 每管中加入2.0 ml WR，充分混匀。

6. 盖上盖子，37℃温浴30 min。

7. 检测前室温放置10分钟。

8. 测量OD562的吸光值。

9. 若在微孔板中测定，需要WR试剂。样品与WR的比例为1：8 or 1：20（当样品有限时）。

10. 各吸取25或10 ul 标准样或蛋白样品，加入微孔中。分别以水或蛋白缓冲液作为标准曲线和蛋白样品的空白对照。

11. 没孔中加入200 μl WR。

12. 盖上盖子，37℃温浴30 min。

13. 检测前室温放置10分钟。

14. 使用酶标仪测量OD562的吸光值。