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蛋白质

蛋白质纯化离子交换法

2024-11-26 蛋白质 加入收藏
各种蛋白质分子上可能带有不同的电性,经过离子交换管柱,可依其分子带电性的差异而分离开来 (Pharmacia 操作手册, Ion Exchange)。仪器设备:

各种蛋白质分子上可能带有不同的电性,经过离子交换管柱,可依其分子带电性的差异而分离开来 (Pharmacia 操作手册, Ion Exchange)。

仪器设备:

塑料管柱 (Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm)

部分收集器 (fraction collector, 另需准备干净试管约60 支)

浓缩用离心机 (低速5,000 rpm) 及浓缩离心管Centriplus

药品试剂:

DEAE Sephacel (胶体体积约15 mL,预先以缓冲液Buffer A-0 平衡好)

Buffer A-0 (如上述配法)

Buffer A-300 溶离液:Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

Buffer A-500 溶离液:Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

方法步骤:

1) 将Econo-Pac 管柱架好,并将三向阀及软管等组合完成。

2) 震荡DEAE Sephacel 胶体使的悬浮,小心倒入管柱中,让胶体慢慢沈降,在沈降过程中随时加入buffer A-0,勿使胶体干掉。

3) 待胶体沈降完全后,高度应在15 cm 左右。胶柱以buffer A-0 一直流洗,流速快慢可以不考虑;连接好收集器,每试管收2.5 mL.离子交换法的胶体平衡极为重要,可测流出液的pH 或离子浓度,看是否与buffer A-0 相同,若不一样则需要再流洗的。

4) 样本的添加方法同上述胶体过滤法,并启动部分收集器开始收集,当样本全部没入胶体后,再加入同体积buffer A-0.以buffer A-0 流洗50 mL 后,去除胶体上方的缓冲液,但勿使胶体干掉。

5) 然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶离的,每批次流洗各50 mL,注意更换浓度时,胶体上方勿残存上一种溶液。

6) 收集后,进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定,结果作图。

7) 收集GUS 活性区,并以Centriprep-30 浓缩至 _______ mL (IEX),记得要保留100 μL.

8) 离子交换胶体以buffer A-0 洗过50 mL 后,收起来交回。


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