亲和层析纯化胰酶

一、实验目的与原理 生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固体载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相的时候，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到于固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。 本实验通过将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。 二、仪器与试剂 1.鸡卵粘蛋白制备 2．Sephadex-G75的活化和偶联 2．5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml水） 3．亲和层析 0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶约50ml 、0.1N甲酸钾、0.5M KCL pH2.5 100ml 仪器器材：抽滤瓶500－1000ml、层析柱、紫外分光光度计、紫外蛋白检测仪、烧杯漏斗、移液管、磁力搅拌器 三、操作步骤 1、鸡卵粘蛋白的制备 2、Sephadex-G75的活化及偶联 2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75溶胀洗涤数次，缓慢搅拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸馏水洗涤数次，抽干备用，活化凝胶，纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝胶，75％K2CO3，调pH7.5-9.0,缓慢搅拌3h。反应过程随时加入5％K2CO3,以维持pH的稳定。0.27gKBH4 溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系反应5h，pH维持在6.5-7.5，洗涤。 3、胰蛋白酶的亲和层析 卵类粘蛋白在pH7－8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合，而在pH2－3时又能解离，因而掌握好上柱地PH条件和洗脱缓冲条件，便可将胰蛋白酶从含杂蛋白地粗酶液中选择性地结合于柱上，待洗去不结合或非专一性结合地杂蛋白后，改变PH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化地目的。由于亲和层析结合地专一性，上柱体积可以比较大，得到浓缩的提纯产品。 (1)亲和层析 将鸡卵粘蛋白－Sephadex-G75装柱（1×10cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2－3倍的柱体积。将粗胰酶液上柱层析。用紫外蛋白监测仪280nm处检测蛋白质吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH7.5的平衡缓冲液冲洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1N的甲酸钾0.5M KCL,Ph2.5的洗脱液解析，柱的流速维持在1.5ml/min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，测总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。 当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱可以反复使用。 （2）胰酶蛋白和活性测定