碱性磷酸单酯酶的分离、纯化实验

本实验作为“大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因克隆、表达”的下游实验，通过对重组基因表达后的基因蛋白碱性磷酸单酯酶的提取、分离与纯化的实验操作，了解所涉及的生化技术中提取（细胞破碎）、分离（离心、盐析、过滤等）、复性（包涵体）、层析（凝胶与离子交换层析 ）、浓缩，与酶蛋白含量和酶活力检测、电泳鉴定及其相关的生物制备与分析的系列操作技术，并结合上游基因克隆与表达的实验操作，使学习与掌握运用这些生化技术制备生化物质的整个过程，以形成现代生物工程技术实际运用与操作的整体概念。 1实验原理 碱性磷酸单酯酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中。与其它分泌蛋白一样，它是以前体的形式分泌的，在膜通道中最终形成成熟的碱性磷酸单酯酶，成为主要存在于质膜上的一种膜结合蛋白。哺乳动物中发现有四种该酶的同工酶，它们通过与GPI Anchor结合连接在细胞膜 上。其中三种是组织专一性的，存在与胎盘，生殖细胞和肠内；另一种是非组织专一性的，被称为肝骨肾型同工酶。 碱性磷酸单酯酶以二聚体形式存在，每条单链47.05kD。这两条链的蛋白序列完全相同，但二级结构有细微差异。每条单链含两个锌离子，一个镁离子和一个磷酸基团，锌离子的作用是稳定酶的三级和四级结构，镁离子参与催化反应，磷酸基团是酶的配基。其中大约每克分子 含有2克原子锌，而在该酶的活性中心含丝氨酸残基。碱性磷酸单酯酶的二聚体的沉降常数为6.2S。金属螯合剂可除去锌离子而使酶失活。该酶在6M尿素存在下，被硫醇作用产生可逆变性。除了Mg2+，其它金属离子如Mn2+ 、Ca2＋、Zn2＋等对酶也有激活作用。 碱性磷酸单酯酶是一种非特异性的水解酶，能水解磷酸单酯键，但不水解磷酸二酯键。它可作用于多类底物，如β-甘油磷酸、葡糖-1-磷酸，腺-磷酸、尿一磷酸和5-磷酸核黄素等。最适温度37℃，最适pH10，对底物只具有相对的专一性，在碱性条件下水解磷酸酯： 单磷酸酯＋水→ 醇＋磷酸 它的抑制剂有二乙三胺五乙酸，N-双（2-羟乙基）呱嗪-N-2（乙磺酸），乙二胺四乙酸（EDTA），邻二氮杂菲，巯基羧酸（如半胱氨酸，巯基乙酸等），焦磷酸盐。氰化物是该酶的强烈抑制剂。 当溶液pH低于3时，该酶释放出锌离子形成单体而失活。该酶对热较稳定，85℃加热30分钟仍保留活性，当有Mg 2＋存在时可增加酶的热稳定性。 本实验采用上游实验载入克隆的碱性磷酸单酯酶基因phoA的大肠杆菌作材料，从培养的菌体中提取、纯化碱性磷酸单酯酶。该菌体表达的碱性磷酸单脂酶以分泌于周质间隙的可溶性蛋白和以包涵体的形式分泌的蛋白组成，可通过细胞破碎以及细胞破碎后溶液的离心来分别获得这二种蛋白。 细胞破碎即指采用一定方法，在一定程度上破坏细胞壁和膜，设法使胞内产物最大程度释放到液相中。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。细胞的破碎根据作用方式不同，基本可以分为两大类：机械法和非机械法。本实验采用的超声波法属于机械法。即输入高能超声波破碎细胞，由于超声波的空穴作用引起的冲击力和剪切力可以使细胞破碎。空穴作用是在超声波作用下经历气泡形成、长大和破碎，在气泡破碎期间，大量声能被转化成机械能，引起局部的剪切使细胞破碎。 细胞破碎液中可溶性蛋白，采用盐析方法加以纯化。 根据不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同而利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出的方法称为蛋白质的盐析。蛋白质水溶液中，蛋白质分子表面的亲水基团能与水进行水合作用，同时水分子受蛋白质极性基团的影响，定向排列在蛋白质周围将蛋白质包围起来，形成由多层水分子构成的水化层。水化层使蛋白质颗粒分开，不会相聚生成大的颗粒而沉淀。蛋白质是兼性分子，在偏离蛋白质等电点的溶液中，蛋白质分子表面同种电荷相斥，也在防止蛋白质颗粒聚集而沉淀。这种蛋白质分子内和分子间极性基团电荷的静电引力，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子极性基团的共同影响，使蛋白质在水中溶解度增大；当盐浓度增加一定程度时，随盐与水形成的水化离子的增加，致使这部分水被电解质夺走，从而夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐溶时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐的浓度可使各种蛋白质分段产生沉淀。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵。 本实验采用硫酸铵分段盐析方法，除去可溶性蛋白液中的部分杂蛋白。初步纯化蛋白再利用层析法进一步纯化。 层析法利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，是目前广泛应用的一种分离技术。层析法中所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，由固体物质组成；另一是流动相，由可以流动的物质组成。当流动相中待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于固定相与流动相间各组份的理化性质存在的差异，使两相间各组份发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同。随流动相在固定相间移动，两相中各组份之间发生相互作用。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。利用随流动相在固定相间移动时的各组份之间发生相互作用次数的加大而差异增大，从而达到将各组份分离的目的。该实验采用Sephadex G-75凝胶的凝胶层析法