大肠杆菌蛋白表达纯化策略

大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。   分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA 克隆 和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA 序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的)，但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。   正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化，但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier 等发展的以噬菌体T7RNA 聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(over-expression)，表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。   一、可溶性产物的纯化   (一)试剂准备   采用T7· Tag Affinity Purification Kit（T7·Tag 抗体琼脂）   大肠杆菌蛋白表达纯化的策略   (二)操作步骤   1.  100 ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000 g×5 min，弃上清，收获菌体，用10 ml 预冷的B/W 缓冲液重悬。   2.  重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4 ℃离心 14000 g×30 min，取上清液，0.45 μm膜抽滤后作为样品液。   3.  将结合T7·Tag 抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。   4.  B/W 缓冲液平衡后样品液过柱。   5.  10 ml B/W 缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。   6.  用5 ml 洗脱缓冲液过柱，每次1 ml，洗脱液用含150 μl 中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE 分析。   7.  将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24 hr，中间换液数次。   8.  用PEG 20000 浓缩蛋白。   (三)注意事项   蛋白在过层析柱前，要0.45 μm 膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。   二、包涵体的纯化   包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态   的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA 聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法(如色谱法)进行重组蛋白质的纯化。   (一)试剂配制   1.  缓冲液A：50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),2 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl。   2.  缓冲液B：50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl，1%NP-40。   3.  缓冲液Ⅰ：50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100(V/V)，4 mol/L 脲素。   4.  缓冲液Ⅱ：50 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，3% Triton X-100 。   5.  缓冲液Ⅲ：50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5%Triton X-100，2 M 盐酸胍。   6.  缓冲液C：8 mol/L 脲素，10 mmol/L β-巯基乙醇，100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，2 mmol/L EDTA及脱氧胆酸钠。   (二)操作步骤   1.  用缓冲液A 漂洗菌体细胞(10 ml/g), 离心6000 g×15 min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A 中洗涤一次。   2.  将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500 g×30 min，收集包涵体沉淀。   3.  将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500 g 离心收集包涵体沉淀。   4.  包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30 min，然后离心1500 g×30 min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。   5.  溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。