X射线晶体成像技术测定蛋白质结构

X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。生物大分子X射线晶体学是揭示分子结构与功能的科学。目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法（X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。对晶体结构的研究将帮助人们从原子的水平上了解物质。

x射线是一种电磁波，能直线传播，使胶片感光。在晶体结构分析中应用的X射线是波长在o．1nm左右的电磁波由于这一波长与晶体内原子间的距离具有同一数量级以及晶体结构内分子排列的规则性，当X射线入射到晶体上时．晶体中的每一个原子都发射出次生的x射线，并相互干涉，形成一个衍射花样。如果将这个过程与光学显微镜成像相比较．两者有相似之处。在显微镜下，一束平行的可见光入射到一个物体上，物体散射入射光，物镜会聚散射光而成像。

对于x射线来说，由于还没有一种材料可作为聚焦镜．因此不可能直接会聚散射光而形成物像，看到晶体内部的结构。但是晶体的衍射花样与晶体内部的结构有一定的关系，即衍射花样内衍射点的排列方式、点间距离的大小与晶体内生物大分子的排列方式和重复周期大小有关，而衍射点的强度分布与生物大分子结构本身的特点有关。

因此，我们可以通过分析衍射点的排列方式和测量点间距离的大小来推算分子在晶体结构中的排列方式和重复周期的大小，以及通过测量衍射点的强度，应用一系列数学方法，借助电子计算机可测定分子内每个原于在空间的坐标，从而测定整个分子的结构和晶体结构。

基本原理

χ-射线衍射是研究药物多晶型的主要手段之一，它有单晶法和粉末χ-射线衍射法两种。可用于区别晶态与非晶态、混合物与化合物。可通过给出晶胞参数，如原子间距离、环平面距离、双面夹角等确定药物晶型与结构。

粉末法研究的对象不是单晶体，而是许多取向随机的小晶体的总和。此法准确度高，分辨能力强。每一种晶体的粉末图谱，几乎同人的指纹一样，其衍射线的分布位置和强度有着特征性规律，因而成为物相鉴定的基础。它在药物多晶的定性与定量方面都起着决定性作用。

当χ-射线（电磁波）射入晶体后，在晶体内产生周期性变化的电磁场，迫使晶体内原子中的电子和原子核跟着发生周期振动。原子核的这种振动比电子要弱得多，所以可忽略不记。振动的电子就成为一个新的发射电磁波波源，以球面波方式往各个方向散发出频率相同的电磁波，入射χ-射线虽按一定方向射入晶体，但和晶体内电子发生作用后，就由电子向各个方向发射射线。

当波长为λ的χ-射线射到这族平面点阵时，每一个平面阵都对χ-射线产生散射。

先考虑任一平面点阵1对χ-射线的散射作用：χ-射线射到同一点阵平面的点阵点上，如果入射的χ-射线与点阵平面的交角为θ，而散射线在相当于平面镜反射方向上的交角也是θ，则射到相邻两个点阵点上的入射线和散射线所经过的光程相等，即PP'=QQ'=RR'。根据光的干涉原理，它互相加强，并且入射线、散射线和点阵平面的法线在同一平面上。

再考虑整个平面点阵族对χ-射线的作用：相邻两个平面点阵间的间距为d，射到面1和面2上的χ-射线的光程差为CB+BD，而CB=BD=dsinθ，即相邻两个点阵平面上光程差为2dsinθ。根据衍射条件，光程差必须是波长λ的整数倍才能产生衍射，这样就得到χ-射线衍射（或Bragg衍射）基本公式：2dsinθ =nλ （5-1）

θ为衍射角或Bragg角，随n不同而异，n是1，2，3……等整数。以粉末为样品，以测得的χ-射线的衍射强度( I ) 与最强衍射峰的强度（I0）的比值（I/I0）为纵坐标，以2θ为横坐标所表示的图谱为粉末χ-射线衍射图。

从衍射峰位置（2θ），晶面间距（d）及衍射峰强度比（I/I0）可得到样品的晶型变化、结晶度、晶体状态及有无混晶等信息。

基本步骤

1、培养大的、质量好的晶体；

2、进行初步的x射线衍射分析；

3、重原子衍生物的制备；

4、衍射数据的测量和处理；

5、相位的计算；

6、电子密度图的计算和解释；

7、分子模型的修正。