细胞裂解液的制备

一、试剂准备 1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:       150 mM NaCL       1% NP-40 (去垢剂)          0.1% SDS (去垢剂)       2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)       2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)   1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)   1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)   1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)   以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。 2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF                    1.5 mM EDTA                    1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选) 3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。 二、实验步骤 1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。 2、        向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。 3、         吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 （置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。 4、        尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。 5、        取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70℃。