生物化学

编码 DNA 结合蛋白的 cDNA 克隆的检测、纯化和鉴定-从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性

2024-12-06 生物化学加入收藏

材料与仪器大肠杆菌 Y1089含有或不含10 mmol L MgCl2的LB培养液 1010pfu mLλgtU重组噬菌体液 1 mol L IPTG 抽提缓冲

材料与仪器

大肠杆菌 Y1089
含有或不含10 mmol L MgCl2的LB培养液 1010pfu mLλgtU重组噬菌体液 1 mol L IPTG 抽提缓冲液 5 mg mL溶于抽提缓冲液中的溶菌酶（保存于-20℃)
4 mol L NaCl 32℃培养箱无菌牙签 0.025μm圆形滤膜（Millipore VS)

步骤

1) 37℃在LB/麦芽糖/氨苄青霉素培养液中培养大肠杆菌Y1089 hflA150生长至饱和。

2) 用LB/MgCl2培养液将细菌悬液稀释100倍，取100μL用5μL 1010pfu/mL λgtll重组噬菌体液感染，32℃温育。

3) 用LB培养液将被感染的细菌悬液稀释1000倍。取100μL涂于LB/氨苄青霉素平板上，32℃温育过夜，每平板可获得约100个菌落。

4) 试验单个菌落的温度敏感生长情况。用消毒牙签将各单菌落分别点种于2块LB/氨苄青霉素平板上。将其中1块置于42℃温育，另1块置于32℃温育。

能在32℃而不能在42℃生长的菌落为溶源菌，其出现频率应为10%〜80%。

5) 在LB/氨苄青霉素培养液中将重组噬菌体溶源菌于32℃培养过夜。

6) 取20μL过夜培养物接种于2 mL LB/氨苄青霉素培养液中。于32℃在有良好通风的情况下培养。

7) 当OD690=0.5 (约3 h)时，将温度调至44℃，培养20 min。

8) 加1 mol/L IPTG至终浓度为10 mmol/L,温度降低至37℃，继续培养1 h。

9) 取1 mL经诱导的培养物在室温下离心45 s。

10) 将沉淀重悬于100μL抽提缓冲液中，迅速在干冰/乙醇中冻结。如果需要，于-70℃保存细胞悬液。