血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

原理

以醋酸纤维薄膜为支撑物，浸入pH8.6的缓冲液后吸去多余液体。将微量血清点于膜上，电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，洗去多余染料。

操作

1. 准备与点样

（1）将薄膜切成2.5×8 cm 的小片。在薄膜无光泽面（正面）的一端约2 cm 处用铅笔划一线，以标明点样位置。

（2）将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上（缓冲液盛于培养皿中），使膜条自然浸湿下沉。

（3）将充分浸透（膜上没有白色斑痕）的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上使点样线架空。

（4）用血色素吸管吸取新鲜血清3~5 ul，涂于载玻片末端处，或用载玻片在血清上蘸一下，使载玻片下端粘上一薄层血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部透入膜内，移开载玻片。

2. 电泳

将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后通电，电压为110 V，电流为0.4~0.6 mA/cm，通电1小时左右关闭电源。

3. 染色

通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。

4. 定量

本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。

5. 计算

光密度总和T=A+α1+α2+β+γ

各部分蛋白质的百分数为：

临床意义

1. 正常值：白蛋白57~72%，α1球蛋白2~5%，α2球蛋白4~9%，β球蛋白6.5~12%，γ球蛋白12~20%。

2. 肝硬化时白蛋白显著降低，γ球蛋白升高2~3倍；肾病综合症时白蛋白降低，α2和β球蛋白升高。

试剂与器材

1. 电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽用有机玻璃或塑料等制成。它有两个电极，用白金丝制成。

2. 巴比妥缓冲液，pH8.6，离子强度0.06

巴比妥钠12.76 g，巴比妥1.66g于蒸馏水中加热溶解后再加水至1000ml。

3. 氨基黑10B染色液

氨基黑10B0.5 g，甲醇50 ml，冰醋酸10 ml，蒸馏水40 ml。

4. 漂洗液配法

95%乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸馏水50 ml 混匀。

注意事项

1. 醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白的正常结果不同于纸上电泳，主要是白蛋白偏高，个别正常人白蛋白仅超过70%。α1，α2，和β，γ都偏低，个别正常人γ球蛋白可低到12%左右。上述正常值仅供参考。

2. 经电泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95%乙醇（2∶8）溶液中20分钟，取出后将薄膜平贴于玻璃板上。干燥过程中，薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计绘出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数。目前国内已有自动定量的光密度计生产。此透明薄膜可长期保存，供教学示教用。

附：迁移率是胶体颗粒的一个物理常数，可用来鉴定蛋白质等物质以及研究它们的某些理化性质。现将人血浆蛋白质的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考