醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质并定量

一、原理

血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0，在pH8.6巴比妥缓冲液中，它们均电离成阴离子，在电场中向阴极泳动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同，所以在电场中的泳动速度不同。一般所来，蛋白质分子量小而带电荷多者，泳动速度快，分子量大而带电荷少者泳动速度慢，因此可以利用其泳速不同将之分开。

血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。

本实验用醋酸纤维素薄膜作为支持物进行电泳，分离各种血清蛋白。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带，从阳极到阴极依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。

醋酸纤维素素薄膜是由二乙酸纤维素加工制成，具有均一的泡沫结构，厚度仅120 mm。醋酸纤维素素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：

1. 电泳后区带界限清晰。

2. 通电时间较短（二十分钟至一小时）。

3. 它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此拖尾现象。

4. 对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素素薄膜水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。

由于醋酸纤维素素薄膜作为支持物进行蛋白电泳，具有以上优点。故本实验最终采用此种方法分离血清蛋白质并加以定量。

二、材料

1. 器材

醋酸纤维素薄膜（2×8 cm），培养皿，点样器，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子。

2. 材料

新鲜血清（未溶血）。

3. 试剂

（1）巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：巴比妥1.66 g， 巴比妥钠12.76 g，加水至1000 ml。置4℃冰箱保存，备用。

（2）染色液：氨基黑10B 0.5 g， 甲醇50 ml，冰醋酸10 ml，蒸馏水40 ml，混匀。

（3）漂洗液：含95%乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸馏水50 ml，混匀。

（4）透明液：冰醋酸25 ml，无水乙醇75 ml，混匀。

三、方法

1. 准备电泳槽

电泳槽内放入巴比妥缓冲液。电泳槽应密闭使蒸汽饱和，避免水分蒸发。将电泳槽与电泳仪接好。

2. 点样

（1）浸泡：用镊子取醋酸纤维素薄膜1张（识别光泽面和无光泽面），无光泽面朝下小心平放在盛有缓冲液的培养皿中，浸泡30 min 左右（浸至无白斑）。

（2）点样：将浸透的薄膜从缓冲液取出（无光泽面朝上），用滤纸吸干多余的液体。点样时，先在点样器上均匀地沾上血清，在距阴极端1.5 cm 处将点样器轻轻地印在薄膜上，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线后迅速离开。

3. 电泳：

电泳槽架上分别用4层纱布连接电泳槽。将点样后的薄膜条置于纱布上，点样面朝下，点样端置于负极侧，薄膜条应平直，并与纱布紧贴。盖好电泳槽盖，静止平衡5 min 后通电，调节电压10~15 V/cm，电流0.5 mA/cm，电泳30~60 min。

4. 染色与漂洗：

（1）电泳完毕后将薄膜取下, 放在染色液中浸泡1~2 min。

（2）漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上，晾干。

5. 定量

（1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4 mol/l NaOH 4 ml，于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620 nm 比色，以空白管调零读m各管吸光度。

（2）计算：

吸光度总和（T）=A+α1+α2+β+γ（吸光度）

血清蛋白组分的相对百分数：

A % = A/T×100%

α1 % = α1/T×100%

α2 % = α2/T×100%

β % = β%/T×100%

γ % = γ%/T×100%