等电聚焦电泳介绍

主要仪器试剂

仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器

试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。

储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；

灌胶

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。

水：5.4ml； 储存液1）：2.0 ml； 载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl； 载体两性电解质溶液pH4-6 240μl； 超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl

灌胶步骤：

1.组装灌胶器；

2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；

3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；

4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；

5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；

6.聚合约1小时；

7.聚合完成，小心拔去梳子；

8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。

注意：

1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；

2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.

样品制备和上样

一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。

变性凝胶上样缓冲液2×Buffer（适用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10载体两性电解质：20μl；3）pH4-6载体两性电解质：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巯基乙醇：50μl；双蒸水：1.7ml；1%溴酚蓝：200μl

电泳：

操作步骤：

1.将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合，10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀；

2.用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部，注意不要溢出来。注意：对于考马斯亮蓝染色液来说，每个泳道10-30μg的蛋白混合粗提物（我们俗称粗抗原）或者5-10μg单一蛋白组分是较合理的上样浓度。

电泳液：

1.上槽中加入阴极电泳液（20mM氢氧化钠：须由1M储存液新鲜配置）；

2.下槽中加入阳极电泳液（10mM磷酸：须由1M储存液新鲜配置）。

等电聚焦电泳条件：

1.接好电极；

2.恒压150V电泳30min；

3.恒压200V电泳2.5h，开始时候控制电流为10mA左右，在聚焦过程中电流有所下降，电泳内室温度在电泳的过程中将升至40－50摄氏度。

测定pH梯度：

1.将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；

2.将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；

3.测读此KCl溶液的pH值、

凝胶的固定：

1.将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min；

2.换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。

凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。