胎盘传播疾病动物模型（胎盘屏障模型）

经胎盘传播是宫内传播的主要方式，宫内传播是指妊娠期间病原微生物等从母体进入胎儿血液和（或）细胞、组织的过程，是宫内感染的基础。胎盘是胎儿与母体之间进行物质交换的重要器官，由滋养层细胞、毛细血管内皮细胞以及二者间基膜所构成的胎盘屏障是营养物质以及某些药物、病毒、激素等从母体进入胎川的必经之路。

原理

胎盘屏障的细胞极性模型构建，采用胰酶消化+密度梯度离心+磁珠分离法分离并鉴定胎盘滋养层细胞，建立原代滋养层细胞培养体系。

用途

目前已发现可引起宫内感染的病毒还有人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、巨细胞病毒（CMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、EB 病毒（EBV）、单纯疱疹病毒（HSV）、风疹病毒（RV）、柯萨奇病毒（Coxsackie vinus）等。因此，胎盘屏障模型的构建具有非常普遍的意义，不仅对研究 HBV 宫内感染机制提供了细胞模型，而且对研究其他病毒的宫内感染有十分重要的参考价值。

材料与仪器

实验材料：

① Transwell；

② 3.0 μm 孔径的聚碳酯膜；

③ 12 孔培养板；

④ DMEM 培养基；

⑤ 冷丙酮；

⑥ OCT。

步骤

经胎盘传播疾病动物模型（胎盘屏障模型）的基本过程可分为如下几步：

A. 采用胰酶消化+密度梯度离心+磁珠分离法分离并鉴定胎盘滋养层细胞，建立原代滋养层细胞培养体系。

B. 采用胶原酶消化+磁珠分离法分离并鉴定胎盘毛细血管内皮细胞，建立原代胎盘毛细血管内皮细胞培养体系。

C. 滋养层细胞与毛细血管内皮细胞共同极性培养模型的建立建立共同培养模型需要使用 Transwell，其底为遍布 3.0 μm 孔径的聚碳酯膜。Transwell 与 12 孔培养板配合使用。首先以 Matrigel 包被聚碳酯膜，而后将其倒置于一培养皿中，接种胎盘毛细血管内皮细胞于聚碳酯膜的下面（图 9-6-5a），细胞密度为 1 × 10/cm2，加入 DMEM 培养基。24 小时后将 Transwell 按正常位置置于 12 孔培养板中，接种滋养层细胞于聚碳酯膜的上面（图 9-6-5b），细胞密度为 1 × 10/cm2，培养基不变，每 2 天换液 1 次。7 天后，前下聚碳酯膜，冷丙酮固定，OCT 包埋，直于聚碳酯膜切片，HE 染色观察两种细胞在膜上的生长情况；同时切片分别用于兔疫组化染色、电镜观察超微结构等。

注意事项

A. 体外 Transwell 上下室共同极性培养，模拟在体胎盘的结构层次，分别将滋养层细胞与胎盘毛细血管内皮细胞接种于微孔膜的上、下面，而不仅仅是简单的两种细胞混合培养，建立共同极性培养模型。采用相差显微镜连续观察细胞的生长情况；扫描、透射电镜观察细胞的超微结构。依据在体胎盘对免疫球蛋白的转运具有特异性及分泌某些激素具有极性的特点，对构建的细胞极性模型功能进行鉴定。

B. 相差显微镜连续观察细胞的生长情况扫描、透射电镜观察细胞的超微结构: 取共同培养第 7 天的细胞，带有细胞的 Transwell，固定，脱水，于扫描电镜观察的标本，干燥，喷金后，观察滋养层细胞表面及细胞连接处有较多微绒毛；用于透射电镜观察的标本，切成 2 mm x 2 mm x 2 mm 碎片，1% 琼脂糖包裏，Epon812 树脂包埋，常规修块，垂直切片，染色，电镜观察细胞之间形成各种连接，靠近顶部能见连接复合体等极性上皮结构。

C. 自 Transwell 上室加入一定量的兔疫球蛋白（IgG、lgM），ELISA 法检测 Transwell 下室中 IgG 及 IgM 的含量，并设空白对照。预期为构建屏障的下室（相当于胎儿循环中）仅检出 IgG，未能检测出 IgM。

D. 采用 RIA 法测定 Transwell 上下室中胎盘生长激素的含量，以明确滋养层细胞极性释放某些激素的功能。预期为仅 Transwell 上室检出胎盘生长激素，而下室中无此激素存在。