qPCR原理和方法都在这里【新手入门】

各位小伙伴们下午好~

疫情当前，作为新型冠状病毒的检测手段之一，想必大家对qPCR检测有一定的好奇，小编偷偷拿到了咱们技术老师的课件给大家来一波分享，往下看哟~

PCR的背景

自从聚合酶链式反应技术（PCR）被发明以来，由于其简单、廉价、可靠、快速、灵敏的优质，PCR是分子生物学中使用最广泛的技术。qPCR是由PCR技术发展出来的一种技术，通过在DNA扩增过程中，以荧光染料侦测每次PCR循环后产物总量的方法，不单有PCR的快速、灵敏，更有专一性更高、可实时监控、可重复精确定量等优势。

图1 PCR原理图

PCR的种类及原理

根据化学发光原理可以分为：

1、SYBR染料法

2、TaqMan探针法

SYBR染料法

SYBR染料法利用SYBR GreenI分子的特点，SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green I 只有和双链DNA结合后才发荧光，游离的染料分子不发光，在新合成链延伸过程中SYBR Green I 掺入双链中，变性时DNA双链解开，SYBR Green I 游离出来，无荧光。

在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreen I 荧光染料， SYBR Green I 荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR Green I 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR染料法需要注意引物的特异性，因为非特异扩增产物和引物二具体均为dsDNA，所以SYBR染料法只能通过引物来保证特异性，SYBR染料法的优点在于简单且成本较低。

图2 SYBR染料法原理图

图3 TagMan探针结构

TaqMan探针法
核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。

反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。

TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。

图4TagMan探针法原理图

PCR的定量方法

定量方法包括相对定量和绝对定量，两者的重要差异在于相对定量的结果是差异性的结果，涉及比较；而绝对定量的结果是一个具体数值，对于基因表达量而言是基因的拷贝数，不涉及任何比较。

相对定量首先需要确定一个内参基因，内参基因作用有检测样本材料中RNA是否降解、纠正样本加样的差异、校正cDNA合成速率差异及校正PCR抑制剂的影响，其本质作用是利用内参基因的Ct值对目的基因的Ct值进行均一化处理，常用的内参基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，使用的时候需要注意其序列必须是物种本身的特异序列，虽然其比较保守，但不同物种也会存在碱基差别。另外，相对定量需要确定参照物，因为涉及比较，参照物选择不同，所得的定量结果可能完全相反，经常选择的参照物一般是对照组或未处理组。

相对定量实验方法包括两种重要方法：

ΔΔCT Method：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因。内参基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；

双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。绝对定量需要由标准曲线建立Ct值跟拷贝数之间的关系，标准曲线由标准品生成，标准品可以是已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成，定量未知模板时标准样品和未知样品必须同时反应。

绝对定量首先需要建立Ct值和拷贝数之间的线性关系，即标准曲线，标曲需要由标准品生成，标准品中基因序列要与待测样品中基因序列一致，从而保证引物在两者中扩增效率完全相同，标准品来源可以是质粒，纯化的PCR产物或者基因组DNA等。标准品在加样时需要注意体积最好大于2微升，以减少标曲误差，标曲是由不同梯度标准品生成，每个标准品梯度建立Ct值与拷贝数对数值之间的联系，落在标曲上的梯度点最好有5个及以上，至少3个点。标准品和待测样品同时反应，将待测样品检测的Ct值代入标曲后即可换算出待测样品中基因的拷贝数。

说了这么多，不知道小伙伴们对qPCR的理解是不是清晰多了呢？qPCR作为一种简单便捷的定量技术，应该是小伙伴们最最最常用的技术了。希望这篇文章能帮助小伙伴们从入门到精通，最终成为自己领域的大牛！