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微生物学

植物病原真菌的分离培养

2024-05-10 微生物学 加入收藏
原理植物患病组织内的真菌菌丝体,如果给予适宜的环境条件,除个别种类外,一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养,从染病植物组织中将病原真菌与其

原理

植物患病组织内的真菌菌丝体,如果给予适宜的环境条件,除个别种类外,一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养,从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开,并从寄主植物中分离出来,再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化,这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法,就是切取小块病组织,经表面消毒和灭菌水洗过后,移到人工培养基上培养。

材料与仪器

植物材料
70%酒精 煤酚皂液 PDA培养基 乳酸 斜面培养基 75%酒精
酒精灯 手术剪 眼科镊 培养皿 小烧杯 大烧杯 恒温箱

步骤

(一)分离前的准备工作


1.工作环境的清洁和消毒


分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行,无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘,并用药物或紫外线照射消毒(常用消毒药物为70%酒精,2%煤酚皂液,5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟)。在没有上述设备条件时,在清洁房间里关闭门窗,避免空气流动,经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作,也可获得较好的结果。工作前擦净桌面,最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上,避免工作时走动,工作人员最好穿上灭菌后的工作服,带上口罩,并用肥皂洗手,用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。


2.分离用具的消毒


凡是和分离材料接触的器皿(刀、剪、镊、针等)都要随时(至少在使用时)保持无菌,将这些用具浸于70%酒精中,使用时在灯焰上灭菌烧去酒精,如此2-3次(刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长,以防退火)。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。


3.分离材料的选择


用新发病的植株、器官或组织做为分离材料,可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面,都可能有腐生微生物的孽生,所以一般斑点病害应从邻近健全组织,即从病、健组织交界处获得分离材料。


(二)植物病原菌的分离


1.叶斑类和枝杆病斑类(非维管束侵染)病原菌分离


首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料,按下述步骤操作:


①培养基平板制备:将PDA培养基在微波炉中加热熔化验,以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中,每皿经12毫升,可形成2-3毫米厚的平板。(为防止细菌污染,倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴)。


②病叶或病枝经自来水冲洗,从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下(若为枝干,则将带有病斑的皮层剥下,但)。


③取10毫升小烧杯经酒带消毒,放入分离材料,倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟,或用1%漂白粉消毒均可。


④消毒后倾出消毒液,用无菌水冲洗2——3,最后一次无菌水不要倒掉。


⑤用灭菌镊,剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块,每块组织均应为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料,放入培养基平板上,轻轻按压。每皿4——5块,排放均匀。


⑥用蜡笔在培养皿上注明分离代号,日期、姓名,将培养皿翻转放置于23—25℃


⑦3-4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落,在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块,转入试管斜面培养基中央,于25℃温箱中培养。


2.种子内病菌的分离


将整粒种子或种子的一部分进行冲洗,再经表面消毒(升汞或漂白粉),最后用灭菌水洗涤后移到人工培养基平板上培养(或者直接放在皿内保湿培养于25℃温箱中)。


3.危害输导组织病原的分离(以枯萎病为代表)


先将分离茎作表面消毒,然后用灭菌刀剥去表皮,剪取其中小块变色的维管束组织,再用漂白粉进行表现消毒后,移于培养基平面上培养。


4.分离物的纯化


前述方法获得分离物,必须经过纯化,才能成为培养,纯化的方法有单孢子分离法和边续稀释培养法两种,后者简便,为了一般研究所常用。


连续稀释法:对真菌材料来说,就是从典型菌落边缘切取含有菌丝的培养基一小块,移植于另一培养基平板上,待菌落形成后,再依此法移植。如此数次,直至菌落形态典型,无杂菌时即可移入斜面试管中培养保存。

注意事项

1. 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行。


2. 在清洁房间里关闭门窗,避免空气流动。


3. 凡是和分离材料接触的器皿(刀、剪、镊、针等)都要随时(至少在使用时)保持无菌。

常见问题

溶液的配制


1、0.1%升汞液的配制:升汞1克,浓盐酸2.5毫升;加水1000毫升。注意要先将升汞用盐酸溶解,然后加水稀释。


2、P.D.A培养基成分;马铃薯200克,葡萄糖10-20克,洋菜17-20克,水1000毫升。


3、水洋菜培养基成分,洋菜17-20克,水1000毫升。


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