附录B
五种致泻大肠埃希氏菌PCR鉴定方法
B.1 试剂和材料
B.1.1 按照表B.1序列在基因合成公司合成引物。
B.1.2 1µL取菌环。
B.1.3 灭菌去离子水。
B.1.4 0.85%灭菌生理盐水。
B.1.5 10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA， pH8.0 TE溶液：量取1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）5 mL、0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0）1 mL于500 mL烧杯中。加入约400 mL去离子水均匀混合，将溶液定容至500 mL，121 ℃高压灭菌15 min，室温保存。
B.1.6 1.5 mL Eppendorf管，8联排管和8联排盖（平盖/凸盖）。
B.1.7 10×PCR反应缓冲液，含840 mmoL Tris-HCl (pH 8.5)和500 mmoL KCl。
B.1.8 25 mmol/L MgCl2。
B.1.9 2.5 mmol/L dNTPs：dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为2.5 mmol/L。
B.1.10 5 U/µL Taq酶。
B.1.11 阳性对照品：包含12对引物扩增的目标DNA序列或者含有目标基因的标准菌株。
B.1.12 50×TAE电泳缓冲液：称量242 g Tris-HCl 和 37.2 g Na2EDTA·2H2O于1 L烧杯中，加入约800mL去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1 mL的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1 L后，室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。
B.1.13 琼脂糖。
B.1.14 溴化乙锭（EB）或其他核酸染料。
B.1.15 6×上样缓冲液。
B.1.16 分子量Marker：至少包含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp条带。
B.1.17 微量移液器及对应吸头：0.5µL～2µL，2µL ～20µL，20µL ～200µL，200µL～1000µL。
B.2 仪器和设备
B.2.1 低温冷冻离心机：控温4℃～8℃，最大转速不小于13000 rpm。
B.2.2 PCR仪。
B.2.3 天平：感量0.01g。
B.2.4 核酸电泳仪，包括电源、电泳槽、制胶槽（长度>10cm）和梳子。
B.2.5 凝胶成像系统或紫外成像仪。
B.2.6 微量加样器：0.5µL～2µL，2µL～20µL，20µL～200µL，200µL～1000µL。
B.3 检测步骤
B.3.1 DNA模板准备
B.3.1.1 将平板或斜面上生长的菌落悬浮于200 µL 0.85%灭菌生理盐水中，充分打散形成菌悬液，13000 rpm离心3 min。
B.3.1.2 弃掉上清液，使用1 mL灭菌去离子水充分混匀菌体，于100 °C水浴或者金属浴维持10 min。
B.3.1.3 冰浴冷却后，13000 rpm离心3 min，收集上清液，用灭菌去离子水按1:10稀释上清液，取2 µL作为PCR检测的模板。
B.3.1.4 也可用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行操作；所有处理后的DNA模板在-20°C以下保存备用。
B.3.2 PCR对照
每次PCR反应使用EPEC、EIEC、ETEC、STEC/EHEC、EAEC标准菌株或阳性对照品作为阳性对照。同时，使用大肠埃希氏菌ATCC 25922作为阴性对照，使用灭菌去离子水作为空白对照，控制PCR体系污染。
B.3.3 PCR反应体系配制及扩增
每个样品初筛需配置12个PCR扩增反应体系，对应检测12个目标基因，具体操作如下：
B.3.3.1 使用TE溶液（pH8.0）将合成的引物干粉稀释成100 µmol/L储存液。
B.3.3.2 根据表B.1中每种目标基因对应PCR体系内引物的终浓度，使用灭菌去离子水配制12种目标基因扩增所需的10×引物工作液（以uidA基因为例，如表B.2）。
表B.1 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个PCR体系内的终浓度
引物名称 | 引物序列c | 终浓度n（µmol/L） | PCR产物长度(bp) |
uidA–F | 5′-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3′ | 0.2 | 1487 |
uidA–R | 5′-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3′ | 0.2 |
escV–F | 5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′ | 0.4 | 544 |
escV–R | 5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′ | 0.4 |
eae-Fa | 5′-ATT ACC ATC CAC ACA GAC GGT-3′ | 0.2 | 397 |
eae-Ra | 5′-ACA GCG TGG TTG GAT CAA CCT-3′ | 0.2 |
bfpB–F | 5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′ | 0.1 | 910 |
bfpB–R | 5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′ | 0.1 |
stx1–F | 5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′ | 0.2 | 244 |
stx1–R | 5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′ | 0.2 |
stx2–F | 5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′ | 0.4 | 324 |
stx2–R | 5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′ | 0.4 |
lt–F | 5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′ | 0.1 | 655 |
lt–R | 5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′ | 0.1 |
stp–F | 5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′ | 0.4 | 157 |
stp–R | 5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′ | 0.4 |
sth–F | 5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′ | 0.2 | 171 |
sth–R | 5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′ | 0.2 |
invE–F | 5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′ | 0.2 | 766 |
invE–R | 5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′ | 0.2 |
ipaH-Fb | 5′-TTG ACC GCC TTT CCG ATA CC-3′ | 0.1 | 647 |
ipaH-Rb | 5′-ATC CGC ATC ACC GCT CAG AC-3′ | 0.1 |
aggR–F | 5′-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3′ | 0.2 | 400 |
aggR–R | 5′-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3′ | 0.2 |
pic–F | 5′-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3′ | 0.2 | 1111 |
pic–R | 5′-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3′ | 0.2 |
astA–F | 5′-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3′ | 0.4 | 102 |
astA–R | 5′-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3′ | 0.4 |
16S rDNA-F | 5′-GGA GGC AGC AGT GGG AAT A-3′ | 0.25 | 1062 |
16S rDNA-R | 5′-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AG-3′ | 0.25 |
注： a：escV和eae基因选作其中一个；b：invE和ipaH基因选作其中一个；c：表中不同基因的引物序列可采用可靠性验证的其他序列代替。
表B.2 每种目标基因扩增所需10×引物工作液配制表
引物名称 | 体积（µL） |
100 µmol/L uidA–F | 10×n |
100 µmol/L uidA–R | 10×n |
灭菌去离子水 | 100 - 2×（10×n） |
总体积 | 100 |
注： n：每条引物在反应体系内的终浓度（详见表B.1）。
B.3.3.3 将10×引物工作液、10×PCR反应缓冲液、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、灭菌去离子水从-20℃冰箱中取出，融化并平衡至室温，使用前混匀；5 U/µL Taq酶在加样前从-20℃冰箱中取出。
B.3.3.4 每个样品按照表B.3的加液量配制12个25 µL反应体系，分别使用12种目标基因对应10×引物工作液。
表B.3 五种致泻大肠埃希氏菌目标基因扩增体系配制表
试剂名称 | 加样体积（µL） |
灭菌去离子水 | 12.1 |
10×PCR 反应缓冲液 | 2.5 |
25 mmol/L MgCl2 | 2.5 |
2.5 mmol/L dNTPs | 3.0 |
10×引物工作液 | 2.5 |
5 U/µL Taq酶 | 0.4 |
DNA模板 | 2.0 |
总体积 | 25 |
B.3.3.5 按照如下反应条件设置PCR仪：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，复性63 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。
B.3.3.6 将配制完成的PCR反应管放入PCR仪中，核查PCR反应条件正确后，启动反应程序。
B.3.4琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物
B.3.4.1 称量4 g琼脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。
B.3.4.2 待琼脂糖溶液冷却至60 ℃左右时，加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5 µg/mL，充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶的长度要大于10 cm，适宜厚度为3 mm～5 mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。
B.3.4.3 当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后，轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔在阴极端。
B.3.4.4 向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，液面高于胶面1 mm~2 mm 。
B.3.4.5 将5 µL PCR产物与1 µL 6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于孔中；阳性对照的PCR反应产物加入到最后一个泳道；第一个泳道中加入2 µL分子量Marker 。
B.3.4.6 接通电泳仪电源，根据公式：电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5 V/cm计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。
B.3.4.7 电泳30 min～45 min后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像系统或紫外成像仪中观察结果，拍照并记录数据。
B.3.5 结果判定
B.3.5.1 电泳结果中空白对照无条带出现，阴性对照仅有uidA条带扩增，阳性对照中出现所有目标条带，PCR检测结果成立。
B.3.5.2 根据电泳图中目标条带大小，判断目标条带的种类，记录每个泳道中目标条带的种类。
B.3.5.3 在表B.4中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。
表B.5 五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表
致病型别 | 目标条带的种类组合 |
EAEC | aggR（+） |
uidAc（+/-）
|
EPEC | bfpB（+/-）, escVa（+）, stx1（-）, stx2（-） |
STEC/EHEC | escV a（+/-）, stx1（+）, stx2（-）, bfpB（-） escV a（+/-）stx1（-）, stx2（+）, bfpB（-） escV a（+/-）, stx1（+）, stx2（+）, bfpB（-） |
ETEC | lt, stp, sth中一条或一条以上阳性 |
EIEC | invEb（+） |
注：a：在判定EPEC或SETC/EHEC时，escV与eae基因等同效果；b：在判定EIEC时，invE与iapH基因等同效果。c：uidA+：97%以上大肠埃希氏菌为阳性。
