ELISA常见样本的处理方法—组织样本

ELISA（酶联免疫吸附剂测定）是一种快速、灵敏、准确可靠的一种定量分析方法，样本的处理对于ELISA实验的成功有着举足轻重的作用。利用ELISA进行检测的样本类型包括常见的血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清以及不常见的皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等，这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到ELISA实验的结果。下面就常见ELISA组织样本处理方法的整理，希望对您有所帮助。

组织样本一般是制成组织匀浆，处理方法如下：

1. 取适量组织块，于预冷PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；
2. 可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入 5-10ml预冷PBS(组织与 PBS 的质量体积比建议为 1:5，即1g 样本加入 5ml PBS)进行充分研磨（有条件实验室可选用机器匀浆），该过程需在冰上进行；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复 2 次）。
3. 将制备好的匀浆液于5000×g 离心5分钟，留取上清即可检测。
4. 如果样本需要长期保存，请添加蛋白酶抑制剂。根据实验需要，组织匀浆样本可先定量总蛋白，以便于统计分析数据。某些组织样本如肝脏，肾脏，脑组织会有假阳性反应。

处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4℃保存应小于 1 周，-20℃不应超过 1 个月，-80℃不应超过2个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。样本的处理是实验成功的第一步，以上就是关于常见样本处理方法的一个简述，供研究者参考。

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PMSF，英文全称为Phenylmethanesulfonyl fluoride，也称为Phenylmethylsulfonyl fluoride或α-Toluenesulfonyl fluoride，中文名称为苯甲基磺酰氟。PMSF是常用的蛋白酶抑制剂，可抑制丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶)。工作浓度通常为0.1~1mM(即17~174μg/ml)。PMSF在水液体溶液中不稳定，30分钟就会降解一半，必须在每一次分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h，补加一次(见水分解，使用前加入)。

PMSF 结构式：

蛋白定量试剂盒

BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量：检测的原理是Cu2+在碱性的条件下，被蛋白质成Cu+，Cu+和BCA相互作用形成紫色的反应复合物，可在562 nm处显示强烈的吸光值，并与蛋白浓度在一定范围内呈现良好的线性关系。

抗干扰Lowry法蛋白定量：其显色原理与双缩脲方法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和氨酸残基还原，产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正相关。联科生物对常规Lowry法进行了改进，既能保证Lowry检测法的准确性，又适用于各种含有干扰物质溶液的蛋白质定量测定。