实验必备技能，一看就会的油红染色指南

有一次老师问我做油红染色的目的是什么？我当然毫不犹豫的就会回答出——组织细胞中脂类的染色，但是当她问我每一个步骤的原理是什么，我却不甚清楚了。

小小的实验，有大大的原理，不知道大家做实验的时候是不是按着protocol按部就班麻木的做，还是先每一个步骤涉及到的知识点吃透再开始做，其实把整个实验吃透，更有助于我们优化实验条件，获得理想的实验结果。今天想分享一下油红染色的protocol以及每个步骤的目的，以及如何用Image pro plus分析油红染色中的脂滴面积比。

01

实验原理

油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色，对其它的细胞结构着色性差。一般认为是物理学上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂质染色，即油红O先溶于60%异丙醇中，然后切片浸入油红O染液中时，油红O在组织脂质的溶解度较60%异丙醇中的溶解度高，所以在染色时油红O从60%异丙醇中转移入脂质中使脂滴显示红色。

02

实验流程

Part Ⅰ

试剂准备

油红O工作液的配制：将储备液5%油红O染液与三蒸水按3:2稀释， 60ml油红O染液+40ml三蒸水，滤纸过滤，室温放置>10min，呈酒红色且无沉淀。现用现配。目的：防止异丙醇长时间放置挥发、油红工作液出现沉淀。

60%异丙醇：30ml异丙醇+20ml三蒸水,4度保存。

1%盐酸酒精分化液：49.5ml 75%乙醇+0.5ml浓盐酸。使用50ml离心管配制，先加入49.5ml 75%乙醇，再去通风橱打开风机，吸取浓盐酸0.5ml，枪头反复吹打几次，关闭风机，颠倒混匀。

Part Ⅱ

染色步骤

Step1

准备好组织切片、油红工作液、75%乙醇、浓盐酸、异丙醇、苏木素、封片剂、放置片子的玻璃器皿等实验材料。

Step2

用PBS洗涤切片3次，每次 5-10分钟。 目的：避免把水带入油红。

Step3

将切片在60％异丙醇中洗涤 5分钟。 目的：提前润洗一下，便于油红着色。

Step4

将切片放于油红染液（异丙醇配制）中避光染色 15分钟。 目的：油红O从60%异丙醇中转移入脂质中使脂滴显示红色。

Step5

将切片在60％异丙醇中浸润 1分钟。 目的：调色，使颜色更亮丽应于镜下控制至脂肪组织呈鲜红色，间质无色为度，或者参考他人文献中的图片调色，建议严格控制时间，时间太长颜色就褪掉了，时间太短颜色不明显， 可适当改变浸润时长，这一步可以在显微镜的辅助下进行，调出自己想要的颜色。

Step6

将切片在 三蒸水洗涤后，放于苏木素染液中染色 5分钟。 目的：将切片上的核染色。

Step7

将切片先在三蒸水中洗涤，再1%盐酸酒精迅速分化 1-2秒。 目的：苏木精染色之后，先用水洗去未结合在切片中的染液。然后用1%盐酸酒精脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料，这个过程称为 染色的分化作用。

Step8

流水缓慢冲洗1-3小时。 目的：使核复蓝，分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，而呈蓝色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化再用温水或弱碱性水使染上苏木精的细胞核变蓝色，称 蓝化作用。

Step9

将切片周围水分吸干，用水性封片剂（甘油明胶等）封片，封片时，发现气泡，不能压盖玻片，以免脂滴移位。或暂时不封片直接观察。

Step10

使用软件Image pro plus分析油红染色中的脂滴面积比，即红色脂肪滴的总面积占所使用的整个×20图像面积的百分比来完成油红定量。

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分析红色脂滴面积比

❶打开Image-Pro Plus 6.0软件，可以选择basic模式、也可以选择complete模式。

❷点击file-open打开实验图片

❸点击count and measure objects

❹点击“Measure”→“Select Measurements”→“Area”、“Per Area（Obj./Total）”→“OK”

❺点击“Manual” →“Select Colors”→“取色器”取图片中的红色脂滴，逐渐选择颜色，直至图片中的所有红色脂滴被标记上→最后点击“Count”

油红染色是 脂类染色的常见技术手段，2020年2月Nature Communications（IF: 11.878）杂志上的一篇论文 “Histone demethylase JMJD1C is phosphorylated by mTOR to activate de novo lipogenesis”，使用油红O染色研究肝脏的脂质积累情况[1]；2020年4月，Science（IF: 41.037）杂志上的一篇论文“Cysteine Depletion Induces Pancreatic Tumor Ferroptosis in Mice”，通过电子显微镜和油红染色观察发现了SLC7A11敲除后细胞出现了异常大的脂滴[2]。

类似的文献还有许多，油红染色其实是一个小实验，但小小的实验里的每个步骤都蕴含了它的意义，而这个小实验也有大用途，在许多高分文献中都能看到它的身影，希望未来有机会在你的CNS paper里看到油红染色！

[2]Badgley MA, Kremer DM, Maurer HC, et al. Cysteine depletion induces pancreatic tumor ferroptosis in mice. Science. 2020;368(6486):85–89. doi:10.1126/science.aaw9872