解锁 Visium FFPE 实验全流程

Visium FFPE 实验全流程

1.样本准备

Visium FFPE 样本制备包含组织石蜡包埋，切片，贴片等过程。

FFPE 样本切片厚度一般为 5μm（区别于冰冻组织样本的 10μm），切片样本大小不宜超过 6.5mm × 6.5mm（载玻片的大小），超出的部分无法被捕获到，反而可能会影响其他样本空间信息。

Tips：组织样本太大怎么办？可以根据不同病变区域分为多个样本。例如，肿瘤组织可以分为中心/边缘/正常组织进行切片观察。

2.质控

FFPE 样本质控包含两个部分：RNA 质量和切片粘附性

由于 FFPE 样本的 RNA 质量较差，RIN 值无法用于 RNA 的质控衡量标准。因此，FFPE 样本的 RNA 质检标准以 DV200>50% 为最低要求。DV200 是指长度大于 200nt 的 RNA 片段占总的 RNA 片段的比例。

另外，对每个FFPE样本，都需要做FFPE贴片粘附性实验。通过切片脱蜡染色再复水，显微成像观察脱片情况，保证正式实验样本切片能牢固的粘附在玻片上，防止后续实验过程中加各种试剂或洗涤浸水导致切片脱落。

3.贴片

对质控合格的样本进行正式试验时，利用切片机，展片机（恒温）和烘片机等设备，将切片组织贴在玻片上，烘片机烘干玻片，干燥剂密封过夜等操作，保证样本切片牢固的粘附在玻片上。

Tips:贴片时组织不要盖住玻片的四个角；贴片无折叠和褶皱，防止玻片和切片间存在气泡。

 

4.染色

FFPE 切片除 HE 染色可观察组织形态和病理结构外，还可以在正式实验切片上进行免疫荧光染色，实现蛋白质与 RNA 的共检测或与 H&E 染色相结合来观察形态背景。

 

5.探针杂交

针对 FFPE 样本中的 RNA 降解问题，Visium FFPE 针对每一个基因（人和小鼠），都预先设计了一对 probe 以靶定RNA的特定序列，通过 probe 与组织内 RNA 杂交，将RNA 信息转移到 probe 上，再将探针两端连接形成完整的 DNA 链。之后降解杂合 RNA 链，透化释放连接的 probe，完成信息捕获过程。

 

6.探针延伸回收建库

捕获的 probe 在玻片上进行延伸反应，生成 cDNA，回收单链 cDNA 并构建测序文库进行上机测序，从而获取基因表达信息。

基于探针设计捕获方式，FFPE 样本文库构建大小在 240bp 左右（区别于冰冻组织），测序深度在 25k reads pair/per spot 左右即可满足分析需要（区别于冰冻组织50k reads pair/per spot）的要求。

总的来说，Visium FFPE 实验过程相较于冰冻切片组织实验，操作更为繁琐，耗时也相对更长，但该技术的出现，使得长期保存的珍贵组织样本基因表达信息获得重现，实现病理图像化和基因数字化的完美结合！