引物溶解引物保存

1. 如何测定引物的OD值？

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50 μL 稀释成1 ml 并在1 ml 标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50 μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

2. 怎样溶解引物？

生工的合成报告单给出了每OD引物稀释为100 μmoL/L（即100 pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH7.5~8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000~4000转/分钟的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。

3. 合成的引物应如何保存？

没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100 μmoL/L 的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。

注意：工作液千万别用TE稀释，要用DEPC水，或去离子水稀释.因为TE可以鏊合镁离子，镁离子对Taq酶活性发挥至关重要，影响PCR反应。

4. 如何检测引物的纯度？

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，<12个碱基的引物用20%的胶，12~60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃，2 min）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600 V 电压进行电泳，一定时间后（约2~3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的（有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带）。

5. 一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗？

没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时需特别注明。

6. 合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办？

PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。

（1）引物和模板是否配对，同源性有多大？

（2）引物本身是否有立体结构.

（3）PCR反应用试剂是否能正常工作？

（4）PCR仪是否工作正常？

（5）PCR反应条件是否合适？