质粒构建技术（双酶切实验）

在探索基因功能的实验中，我们需要过表达目的基因以判断其发挥的功能，因此我们需要将目的基因构建到表达载体上，再将载体通过侵染或瞬时表达的方式转入植物。双酶切实验可以将载体由环状变为线状，线状载体和带有同源臂的目的基因进行同源重组即可完成载体构建。

核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链 DNA 中特定碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来 DNA 的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，他们以内切方式水解核酸链中的磷酸二醋键，产生的 DNA 片段 5' 端为 P，3' 端为 OH，由于限制性内切酶能识别 DNA 特异序列并进行切割。

表达载体，限制性内切酶，酶切反应缓冲液

1. 选择酶切位点。根据表达载体上多酶切位点的情况，选择合适的酶切位点，一般不选择位置相距很近的酶切位点以保证酶切效率。（红框内为多酶切位点区域）

2. 根据选择的酶切位点，选择合适的酶切反应缓冲液（一般会随限制性内切酶赠送）。

图示为某品牌限制性内切酶对应酶切反应缓冲液对照表，如选择 BamHⅠ和 Acc Ⅰ为酶切位点，则需要 0.5xK 缓冲液做为反应缓冲液。

3. 反应体系（总体系 50 μl）： 酶Ⅰ 1.5 μl

                                         酶Ⅱ 1.5 μl

                                         Buffer（按照说明书即可）

                                         载体 15 μl（不超过推荐的 DNA 最大用量）

                                         补水至 50 μl

4. 37 ℃ 水浴（金属浴或 PCR 仪均可）4 h。

5. 水浴到时间后通过加入 loading buffer 或使用热灭活的的方式终止反应。

6. 琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果（未酶切的载体作为对照）由于酶切后的载体为线性 DNA，未酶切的载体为环状 DNA，在电泳时线性 DNA 的迁移率更低，所以二者的电泳结果不会处于同一位置，以此来判断酶切结果。

7. 将酶切好的条带切下进行胶回收即可。

1、步骤 1 中，选择酶切位点时一般要尽量避免目的基因中含有相同的酶切位点，然而并不是所有情况下都可以避免，因为有些目的基因几乎含有载体中所含的全部酶切位点，如果遇到此类基因，务必要保存表达载体空载，一旦载体构建完成，目的基因含有酶切位点的表达载体很难再次改造。

2、步骤 2 中，公司附赠的缓冲液可能是 10x 缓冲液，选用时需要看清浓度。

3、步骤 3 中，此反应体系为作者常用的反应体系，实际操作中，载体量应严格按照限制性内切酶的说明书中推荐用量的要求，不然可能会影响酶切效率，导致未线性化的载体偏多，影响后续同源重组的阳性率。

4、酶切好胶回收后的载体不易长期使用，回收后两周以内效率较高。

1. 问：在后续实验中，同源重组总是连接不上怎么办？

答：步骤 6 中的电泳验证，只能说明载体已经成为线性载体，但是我们需要的双酶切均把载体切开，所以有可能是酶切效果不好导致。如果总是连接不上，并且经过同源重组试剂盒中对照载体及片段重组及转化，确认重组反应及转化环节正常时，建议重新酶切。

2. 问：总是切不开怎么办？

答：根据经验来说，可以把步骤 4 换一种加热方式，不同实验室情况不同，可能是选用的加热方式不稳定导致。或者考虑后续使用单酶切、反向 PCR 等方法重新线性化载体。