杆状病毒表达系统的建立

杆状病毒是双链 DNA 病毒，主要感染昆虫，也感染体外昆虫细胞系，对人畜无毒害。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是目前宿主最广、应用最多的杆状病毒，它与草地贪夜蛾 Sf21 细胞系建立了广为应用的 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统。

该系统表达的外源基因，表达量多，能进行产物加工、修饰和折叠，形成有生物活性的产物，是当今基因工程领域中的四大表达系统之一，已表达上千种外源基因。

Bac-to-Bac 系统的技术原理是该系统主要包括供体质粒 pFastBac，大肠杆菌 DH5a、DH10Bac，昆虫 Sf21 细胞等。供体质粒 pFastBac 上有 Tn7 的左右臂序列，两臂之间是病毒多角体基因 polyhedrin 的强启动子及其下游的多克隆位点、polyA位点，庆大霉素抗性基因等。

将外源基因连接到供体质粒上，转化 DH5a 感受态细胞，提取重组供体质粒，再转化 DH10Bac 感受态细胞。该细胞含有穿梭质粒 Bacmid 和辅助质粒 helper，Bacmid 上有 F 复制子，卡那霉素抗性基因及 lacZa 肽段编码基因，LacZa 基因上有细菌转座子 Tn7 的附着位点 mini-attTn7。重组供体质粒的 Tn7 在 DH10Bac 中 helper 编码的转座酶帮助下转座到 Bacmid 上的 mini-attTn7 位点，干扰了 LacZ 的表达。

因此具有重组 Bacmid 的 DH10Bac 在庆大霉素、卡那霉素、四环素（辅助质粒对四环素有抗性）及含有 X-gal、IPTG 的培养板上形成白色菌落。提取重组 Bacmid，脂质体法转染昆虫 Sf21 细胞，在培养液中可获得重组病毒，重组病毒可继续感染昆虫细胞，外源基因随着病毒扩增而表达。供体质粒 pFastBacDUAL 有两个克隆位点，一个位于 poly-hedrin 的启动子下游，一个位于 p10 启动子下游，用它构建的重组病毒感染细胞后表达两种蛋白。

有的学者把绿色荧光蛋白基因构建到 p10 启动子下游，表达的绿色荧光作为标记蛋白。

昆虫杆状病毒表达系统的建立的基本过程可分为如下几步：

（一） 试剂配制

(1) LB 液体培养基：NaCl 10 g，酵母提取物 5 g，蛋白胨 10 g，然后用 NaOH 调节 pH 至 7.0，定容至 1000 mL，103.4 kPa 灭菌 20 min。LB 固体培养基：每升 LB 液体培养基补加琼脂粉 15 g，灭菌 20 min。

(2) Luria Agar 固体培养基：每升含胰化蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉 15 g，pH 7.0~7.2，15 lbf/in2，103.4 kPa 灭菌 20 min。

(3) SOC 培养基：先配 SOB 培养基：胰化蛋白胨 2 g，酵母提取物 0.5 g，NaCl 0.05 g，250 mmol/L KCl 溶液 1 mL，定容至 100 mL。然后用 NaOH 调 pH 至 7.0，10 lbf/in2，68.9 kPa 灭菌 30 min，4 ℃ 放置。用时在 10 mL SOB 培养基里加入灭菌的 50 μL 2mol/L 的 MgCl2 溶液及 200 μL 无菌抽滤的1 mol/L 葡萄糖。

(4) Grace's完全培养液：Grace's昆虫细胞培养基补加碳酸氢钠 0.35 g/L，lactalbuminhydrolysalate 及 yeastolate 各 3.33 g/L 后用超纯水充分溶解，1 mol/L NaOH 调 pH 至 6.0，定容 1 L，无菌抽滤后分装，-20 ℃ 存放。用时添加胎牛血清至 10％。

（二） 重组供体质粒构建

(1) 连接：选取限制性内切酶如 EcoRI/XhoI 分别酶切供体质粒和外源基因片段，T4 连接酶连接，16 ℃ 过夜。

(2) 转：DH5a 5 μL 连接液加入到 100 μL 冰浴融化的 DH5a 感受态细胞中，冰浴 30 min，42 ℃ 热激 60 s，冰上冷却 2 min，加入 400 μL SOC 培养基，37 ℃，225 r/min 振荡培养 1 h，离心收集细胞。用适量 SOC 培养基稀释菌体细胞，涂布在含氨苄青霉素 100 μg/mL，X-gal 100 μg/mL，IPTG 40 μg/mL 的 LB 固体培养基平板上，37 ℃ 倒置培养 24~48 h。

(3) 蓝白斑筛选：挑起平板中央数个独立白斑，PCR 及酶切验证是否重组了外源基因。

(4) 重组质粒提取：阳性白斑扩增培养，用质粒提取试剂盒提取重组的供体质粒。

（三） 转座获得重组 bacmid

(1) 转化：DH10Bac 1 μL 重组供体质粒稀释至 10 μL 水中后加入到 100 μL 冰浴融化的 DH10Bac 感受态细胞中，冰浴 30 min，42 ℃ 热激 45 s，冰上冷却 2 min。加入 900 μL SOC培养基，37 ℃，225 r/min 振荡培养 4 h，离心收集细胞，用适量 SOC 培养基稀释菌体细胞。涂布在含卡那霉素 50 μg/mL，庆大霉素 7 μg/mL，四环素 10 μg/mL，X-gal 100 μg/mL，IPTG40 μg/mL 的 Luria 固体培养基平板上，37 ℃ 倒置培养 24~48 h。

(2) 蓝白斑筛选：挑起平板中央数个独立白斑，PCR 及酶切验证是否重组了外源基因。

(3) 重组质粒提取：阳性白斑扩增培养，用质粒提取试剂盒提取重组 bacmid。带 GFP 标记蛋白的重组 pFastBacDUAL。

（四） 转染

(1) 10 μL cellfectin 加无菌水至 25 μL，轻轻混匀 5 min。

(2) 将 60 ℃ 水浴 1 h（灭活微生物）的 25 μL 重组 Bacmid（对照组用不含外源基因的Bacmid 代替）加入脂质体中，室温 1 h，期间每隔 10 min 轻弹管底混匀一次。

(3) 将指数生长期的 Sf21 细胞的含血清培养液换成 2 mL 无血清 Grace's 培养液，1 h 后更换 2 mL 新的无血清 Grace's 培养基。并将上述 Bacmid/脂质体混合物轻轻点在培养基上，27 ℃ 静置培养 5~6 h 后，换 2 mL 含 50 U/mL 庆大霉素和 10％ 胎牛血清的 Grace's 完全培养液。

(4) 27 ℃ 继续培养 3~5 d 后收集上清培养液，4 ℃ 避光存放，以备感染用。

（五） 感染扩增、收集重组蛋白

(1) Sf21 细胞生长至 80％ 密度时，弃培养液，加入上述收集的转染后含重组病毒的上清培养液。

(2) 27 ℃ 静置培养 1.5 h 后，更换 4 mL 新的 Grace 培养液继续培养 3~5 d，分别收集上清（含芽生病毒 Budded virus，BV）及细胞，进行重组表达产物的纯化及鉴定。

(3) 上清中含重组病毒芽生病毒，可离心弃细胞碎片后继续用于感染。

（六）重组蛋白的检测 SDS-page 或 Western blotting 法检测

（1）扩增的外源基因的 PCR 产物两端要有限制性内切酶位点序列，且该序列应与将要连接的供体质粒的限制性内切酶序列一致。

（2）转化 DH5a 及 DH10Bac 固体培养基平板上的抗生素及 X-gal、IPTG 要涂布均匀，然后放至培养箱半小时后才能使用，否则对菌体细胞毒性大，无法形成菌落。

（3）重组 Bacmid 在与脂质体混合前要用 60 ℃ 水浴灭活，以避免转染培养时污染。转染前 Sf21 细胞应换不含血清的 Grace's 培养液，1 h 后更换 2 mL 新的无血清 Grace's 培养基，再加入 Bacmid/脂质体混合物，否则转染率低。