原位缺口平移技术
简介
原位切口平移技术又称为原位缺口翻译(in situ nick translation)。它最早用于研究DNA体外复制,其后又扩展至研究染色体、培养细胞与组织切片的DNA转录效力。
它一方面具有实感性,便于观察记录;另一方面也可作半定量(计数银颗粒)或定量(收集细胞作液闪测定)测定,其优点是显而易见的。
本技术是在分子水平上反映遗传物质的改变,因此其敏感性要比诸如染色体畸变、断裂、姊妹染色单体交换频率改变、微核形成以及碱洗脱法与荧光分析法敏感得多。
在实用上又有外加DNase I与不加DNase I两种。
前者主要用以区别有无转录活性或潜在转录活性的染色质或基因;而后者主要用于检测致癌物、致突变物或辐射等因子对细胞DNA的断裂损伤作用。
原理
原位切口平移技术的基本原理是大肠杆菌DNA聚合酶I(Escherichia coli DNA polymerase I)可从一条DNA链缺口(nick)的5'端切除核苷酸,同时从缺口的3'端连接核苷酸,并依次顺序进行,其结果切口沿DNA平移。
因此,新合成的数量可反映出DNA链的断裂(受损)的程度。原位缺口平移技术,乃是将缺口移位技术与同位素放射自显术结合起来,从而可在细胞核或染色体上反映出DNA受损的程度。
材料与仪器
器材:
①显微镜
②PCR仪
③紫外检测仪
④高速离机、恒温水浴箱、高速真空干燥机
试剂:
①材料:培养的细胞
②Carnoy 固定液
③500 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),50 mmol/L MgCl2, 100 mmol/La-巯基乙醇
④10 mmol/L dATP、dGTP、dCTP、dTTP,3H-dTTP
⑤BSA
⑥大肠杆菌 聚合酶I
步骤
原位切口平移技术的基本过程可分为如下几步:
(1)细胞培养及处理 实验可用正常细胞或恶性细胞,视实验目的而定,将细胞接种于预先放置有盖片(2.2 cmx2.2 cm)的小号塑料培养皿内(直径3.4 cm)。
每皿加2ml含适量血清与抗生素的培养基(如DMEM)。每皿的细胞总数为3x105个。将培养皿放入37 ℃ CO2孵箱内。
24 h后细胞已很好地贴附在盖片上,吸去培养基,以不含血清的DMEM洗2次,加入不含血清的DMEM或含有一定浓度测试药物(如本实验以MNNG,醋酸棉酚为例)的DMEM。
(2)细胞的固定 在经上述测试药物作用一定时间后,将盖片取出,以PBS(pH 7.4)洗涮,清除细胞碎片等。
然后用3:1的冰醋酸-甲醇Carnoy 液固定15 min,待晾干后用树胶将上述附着有细胞的盖片固定于载片之一端。
须记住的是细胞面朝上!1 d后树胶干涸,进行下一步的原位缺口平移反应。
(3)原位缺口平移反应 于上述盖片上,滴加30 μl缺口平移反应液,使其淹没细胞,并以另一张清洁盖片覆盖其上,须注意不要有气泡,以确保反应液浸渍所有的细胞。
为此,要先准备混合液A,然后再配制反应液。本实验以10张标本为例,以示需配多少溶液。
①混合液A 500 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),188 μl;50 mmol/L MgCl2,188 μl; 100 mmol/Lα-巯基乙醇,188 μl;10 mmol/L dATP,5.64 μl;10 mmol/L dGTP,5.64 μl; 10 mmol/L dCTP,5.64 μl;10 mmol/L dTTP,5.64 μl。
②反应液 混合液A,96.3 μl;3H-dTTP,16 μl;大肠杆菌聚合酶I(200 U/ml),30 μl;BSA(2 mg/ml),15 μl;双蒸水,145.4 μl。
(4)终止反应 15 min后移去上覆的盖片,用50 mmol/L Tris-HCI(pH 7.4)洗涮数次,以洗去反应液。
接着再以95% 乙醇浸渍30 min,晾干后(约30 min),进行同位素自显术程序。
(5)放射自显术 将上述经原位缺口移位反应的盖片在暗室内浸渍Kodak放射自显术乳胶(也可用核IN乳胶),但乳胶应事先在室温中预温,通常可稀释1倍。
晾干后(约30 min)置于装有干燥剂的密闭容器内,4 ℃曝光3 d。
(6)显影与定影 放射自显术的显影剂与定影剂。这里我们推荐用D19液,显影5 min,定影10 min,然后自来水漂洗15 min。
(7)标本的染色 标本可用吉姆萨染色。笔者推荐地衣红(orcein)染色,其流程如下:2% 地衣红染色10 min;
水洗数秒钟;冰醋酸-水混合液(1:1)洗数秒钟;95% 乙醇处理1 min;正丁醇、正丁醇-二甲苯混合液(1:1)、二甲苯I、二甲苯II各处理数秒钟;中性树胶封片。
(8)观察与记录在油镜下记数每个细胞核中的银颗粒数、同时减去相等面积的本底颗粒数,即为每个核中的真正银颗粒数。
一般要随机取视野,共观察100个细胞以上,同时做显微摄影记录。如做定量分析,则可收集细胞,进行液闪测定,各组互相比较。
注意事项
(1)目前已有原位缺口平移反应液药盒出售,可不必自行配制。
(2)若没有3H-dTTP,也可用3H-TdR代替。