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DNA实验

痘苗 DNA 检测实验Southern 杂交法

2024-05-20 DNA实验 加入收藏
原理以前,用 HindIII 限制性内切核酸酶消化鉴定痕苗病毒 DNA。大部分的外源基因插入重组病毒的 TK 基因中,TK 基因位于 HindIII 5.1 k


原理

以前,用 HindIII 限制性内切核酸酶消化鉴定痕苗病毒 DNA。大部分的外源基因插入重组病毒的 TK 基因中,TK 基因位于 HindIII 5.1 kb 的 J 片段上。这样在重组病毒中,如果插入片段上没有 HindIII 内切酶位点,则J片段就会增大。如果缺乏 HindIII 5.1 kb 的J片段,说明没有污染野生型痘苗病毒。Southern 杂交可以分析提纯病毒的 DNA,也可分析感染细胞的初级裂解物。

材料与仪器

生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞 重组痘苗病毒储液
完全 MEM-5 和 MEM-10 培养基 PBS 胰酶 低盐缓冲液 蛋白酶K 平衡的苯酚 1:1 苯酚氯仿 TE 缓冲液 乙酸钠 乙醇 HindIII 限制性内切核酸酶和相应缓冲液
12 孔组织培养板

步骤


1. 用生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞建立用于病毒感染的细胞培养液(见基本方案 1 步骤 1~5)。


2. 用完全 MEM-10 培养基将 2.5 × 105 细胞/孔放入 12 孔组织培养板培养(每孔终体积为 1 ml),细胞汇片生长(应小于 24 h)。


3. 在使用前,将一定体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合,涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min,并在保温过程中每隔 5~10 min 涡旋混匀一次。


病毒储液的滴度常常在 2 × 109 pfu/ml 左右,但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。


如果经过涡旋混匀后,还可以看见团状物,将其冷却到 0℃ 并在冰上超声波作用 30 s。可以重复几次超声,但超声的间隔中应当使样品在冰上冷却。


4. 吸出培养基,加入 250 μl MOI 为 10~20 pfu/细胞的完全 MEM-5 培养基,培养 2 h, 每隔 30 min 轻轻摇动培养板,使细胞均匀接触病毒。


5. 加入 1 ml 完全 MEM-5 培养基,培养大约 24 h。


6. 刮下细胞,转移到微量离心管中,最大转速室温离心 30 s,弃培养基。


7. 将沉淀用 50 μl PBS 重悬,涡旋混匀。


8. 在微量离心管中加入 300 μl 低盐缓冲液和 10 μl 的 20 mg/ml 蛋白酶 K,再加入细胞悬液,涡旋混匀, 37℃ 放置 5 h 到过夜。


9. 用等体积苯酚抽提 1 次,再用 1:1 的苯酚/氯仿抽提 1 次。


如果苯酚抽提后,溶液比较黏稠,将其过 25-G 的针头,以剪切 DNA 降低黏稠度。


10. 加入 1/10 体积的 pH 6.0 的 3 mol/L 乙酸钠(终浓度为 0.3 mol/L)和 2.5 倍体积 95% 的乙醇。于冰上放置 30 min 或 -20℃ 放置过夜。


11. 4℃ 以最大转速离心 10 min,弃上清。


12. 用冰浴的 70% 乙醇洗涤,空气中晾干。


13. 用 100 μl pH 7.8 的 TE 缓冲液溶解沉淀。


14. HindIII 限制酶消化 15 μl DNA 溶液,Southern 印迹及杂交分析鉴定。

注意事项

1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养,除非有特殊说明。


2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的,操作也必须是无菌操作。


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