痘苗 DNA 检测实验斑点杂交法
材料与仪器贴壁生长良好的单层 BS-C-1 或 HuTK-143B 细胞 重组病毒噬斑悬液NaOH Tris • Cl 2SSC PBS 胰酶／EDTA 干冰／
材料与仪器
贴壁生长良好的单层 BS-C-1 或 HuTK-143B 细胞 重组病毒噬斑悬液
NaOH Tris • Cl 2×SSC PBS 胰酶／EDTA 干冰／乙醇 DNA 提取缓冲液 乙酸钠 乙醇 PCR 扩增缓冲液 引物 完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基 完全 MEM-10／BrdU 培养基 筛选试剂 4 dNTP 混合物 MgCl2
硝酸纤维素膜 Whatman 3 MM 滤纸 80℃ 真空干燥箱 24 孔组织培养板 杯状超声仪
NaOH Tris • Cl 2×SSC PBS 胰酶／EDTA 干冰／乙醇 DNA 提取缓冲液 乙酸钠 乙醇 PCR 扩增缓冲液 引物 完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培养基 完全 MEM-10／BrdU 培养基 筛选试剂 4 dNTP 混合物 MgCl2
硝酸纤维素膜 Whatman 3 MM 滤纸 80℃ 真空干燥箱 24 孔组织培养板 杯状超声仪
步骤
1. 病毒感染细胞并完成筛选（见「PCR 法」步骤 1~9）。
2. 轻轻刮下细胞，转移到离心管中，最大转速离心 30 s，弃培养基，用 200 μl PBS 重悬。24 孔培养板中的细胞也可用 1ml 的注射器的活塞刮取。
3. 冻融并超声细胞悬液（见「PCR 法」步骤 11、12）。
4. 将硝酸纤维素膜剪至适合点迹仪大小，将其用水浸湿，放入仪器中，每孔中加入 20~100 μl 的细胞悬液（步骤 3），用抽吸的方法使液体流过硝酸纤维素膜，随后将膜取出。
5. 剪 6 片 Whatman 3 MM 滤纸，使其稍大于硝酸纤维素膜，将一块 Whatman 3 MM 滤纸用 0.5 mol/L NaOH 浸湿。把硝酸纤维素膜放在湿润的滤纸上 1 min。移开硝酸纤维素膜，将其放在干燥的滤纸上 1 min。用同样的滤纸重复此步骤 2 次。使用镊子移开硝酸纤维素膜。
6. 用浸润过 1 mol/L Tris • Cl pH 7.5 溶液的滤纸按步骤 5 的方法处理硝酸纤维素膜 （每张膜 3 次）。
7. 用浸润过 2 × SSC 溶液的滤纸按步骤 5 的方法处理硝酸纤维素膜（每张膜 3 次）。
8. 用 80℃ 真空干燥箱烘烤硝酸纤维素膜 2 h。
9. 进行 DNA 杂交。
注意事项
1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养，除非有特殊说明。
2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。
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