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DNA实验

用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针

2024-05-20 DNA实验 加入收藏
原理本方案以 poly(A) + RNA 作为模板,通过随机引物反应合成 cDNA 探针,这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。材料与仪器反转录酶 反转录酶


原理

本方案以 poly(A) + RNA 作为模板,通过随机引物反应合成 cDNA 探针,这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。

材料与仪器

反转录酶 反转录酶缓冲液 随机脱氧核苷酸引物 模板 mRNA
乙酸铵 DTT EDTA 乙醇 HCl NaOH 酚 氯仿 胰 RNA 酶抑制剂 SDS Tris-Cl dNTP 溶液
冰水浴 Sephadex G-50 离心柱 水浴或加热板

步骤

一、材料

1. 缓冲液与溶液

乙酸铵(10 mol/L)

DTT (1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0)

乙醇

HCl ( 2.5 mol/L)

NaOH ( 3 mol/L)

酚:氯仿(1:1,V/V)

胰 RNA 酶抑制剂(20 单位/μl )

SDS ( 10% m/V)

Tris-Cl ( 1 mol/L,pH 7.4)

2. 酶和缓冲液

反转录酶

10X 反转录酶缓冲液

3. 核酸与寡核苷酸

含有 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液

dCTP ( 125 μmol/L)

长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物

模板 mRNA

4. 放射性化合物

[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml,比活性为 >3000 Ci/mmol)

5. 专用设备

冰水浴

Sephadex G-50 离心柱,平衡于 TE(pH 7.6)

预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板

二、方法

1. 将 1 μg poly(A)+RNA 转移至消毒的微量离心管。用无 RNA 酶的水将溶液的体积调至 4 μl。盖紧微量离心管盖,于 70℃ 加热 5 min,然后迅速将离心管转至冰水浴中。

2. 在微量离心管的冷溶液中加入:

10 mmol/L DTT                                    2.5 μl

胎盘 RNA 酶抑制剂                              20 单位

随机脱氧寡核苷酸引物                          5 μl

10X 反转录缓冲液                                 2.5 μl

20 mmol/L dGTP、dATP 和 dTTP 溶液  1 μl
 
125 μmol/L dCTP 溶液                          1 μl

10 mCi/ml [α-32P] dCTP

( 比活性为 > 3000 Ci/mmol)                  10 μl

无 RNA 酶的水                                     加至 24 μl

反转录酶(200 单位)                          1 μl

3. 加入下列试剂以终止反应:

0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)                1 μl

10% (m/V)SDS                          1 μl

充分混合管中的试剂。

4. 在反应管中加入 3 μl 3 mol/L NaOH,68℃ 温育混合物 30 min 以水解 RNA。

5. 使反应混合物的温度冷却至室温,加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl(pH 7.4)以中和溶液,混匀,然后加入 3 μl 2.5 mol/L HCl。取极小量液体滴在 pH 试纸上,以检测溶液的 pH。

6. 用酚:氯仿抽提纯化 cDNA。

7. 用离心柱层析或在 2.5 moI/L 醋酸铵存在下用乙醇选择性地沉淀放射性标记的探针以与未掺入的 dNTP 分离。

8. 用三氯乙酸(TCA)沉淀法或 DE-81 滤膜结合法来确定放射性标记 dNTP 掺入的比例。


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