寡核苷酸介导的诱变实验基本方案
材料与仪器大肠杆菌PEG TE ATP 寡核苷酸诱变引物 T4多核苷酸激酶 EDTA SSC水浴锅 电泳仪 培养箱步骤1. 将一个单链噬菌体产生的噬斑转移至含
材料与仪器
大肠杆菌
PEG TE ATP 寡核苷酸诱变引物 T4多核苷酸激酶 EDTA SSC
水浴锅 电泳仪 培养箱
PEG TE ATP 寡核苷酸诱变引物 T4多核苷酸激酶 EDTA SSC
水浴锅 电泳仪 培养箱
步骤
1. 将一个单链噬菌体产生的噬斑转移至含有1 ml 灭菌TY培养基的1.5 ml 微量离心管中，60℃温育5 min，以杀灭细菌细胞，剧烈振荡以释放琼脂中的噬菌体，离心2 min。
（1）20 μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液
（2）2 μl 10 mmol/l ATP
（3）突变的寡核苷酸（长15~20个核苷酸〉
（4）加水至20 μl
（5）2 U T4多核苷酸激酶
（6）37℃温育60 min，加3 μl 100 mmol/l EDTA并加热至70℃终止反应。
（5）充分混匀，然后置于0℃5 min，室温5 min，37℃2 h。
（6）最后加3 μl 500 mmol/l EDTA终止反应。
2. 将100 μl 上清转移至1 L 的烧瓶，瓶中装有100 ml 培养基，其中含0.25 μg/ml 的尿苷。
3. 加5 ml 处于对数生长中期的大肠杆菌培养液，于37℃剧烈 振摇培养6~18 h。
4. 以5 000 g 离心30 min，保留上清。
5. 确定噬菌体在ung-大肠杆菌对ung+大肠杆菌中的相对滴度。
3. 加5 ml 处于对数生长中期的大肠杆菌培养液，于37℃剧烈 振摇培养6~18 h。
4. 以5 000 g 离心30 min，保留上清。
5. 确定噬菌体在ung-大肠杆菌对ung+大肠杆菌中的相对滴度。
4. 毎4体枳的上清加1体积的5×PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体，混匀，0℃温育1 h。
6. 5 000 g 离心15 min，倒弃上清，在15 ml Corex管内用5 ml TE缓冲液溶解沉淀，在旋涡混合器上剧烈振荡。
7. 将噬菌体溶液置冰上1 h，如上步再次离心以去除细胞碎片，再用酚抽提和乙醇沉淀单链噬菌体DNA，通过测260 nm 吸光值确定DNA浓度。
6. 5 000 g 离心15 min，倒弃上清，在15 ml Corex管内用5 ml TE缓冲液溶解沉淀，在旋涡混合器上剧烈振荡。
7. 将噬菌体溶液置冰上1 h，如上步再次离心以去除细胞碎片，再用酚抽提和乙醇沉淀单链噬菌体DNA，通过测260 nm 吸光值确定DNA浓度。
8. 在1.5 ml 微量离心管内加入下列试剂：
（1）20 μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液
（2）2 μl 10 mmol/l ATP
（3）突变的寡核苷酸（长15~20个核苷酸〉
（4）加水至20 μl
（5）2 U T4多核苷酸激酶
（6）37℃温育60 min，加3 μl 100 mmol/l EDTA并加热至70℃终止反应。
9. 加含尿嘧啶的单链环状DNA模扳（通常为1 μg DNA溶解在1 μl 体积）至磷酸化的寡核苷酸中，加1.25 μl 20×SSC，充分混匀，离心5 s。
10. 将离心管放入一个盛有70 ℃水的500 ml 烧杯中，自然冷却至室温后离心5 s，置于冰上。
11. 加入下列试剂以形成杂交混合液：
（1）20 μl 5×聚合酶混合物
（2）2.5 U或T4 DNA聚合酶
（3）2 U T4 DNA连接酶
（4）加水至100 μl
10. 将离心管放入一个盛有70 ℃水的500 ml 烧杯中，自然冷却至室温后离心5 s，置于冰上。
11. 加入下列试剂以形成杂交混合液：
（1）20 μl 5×聚合酶混合物
（2）2.5 U或T4 DNA聚合酶
（3）2 U T4 DNA连接酶
（4）加水至100 μl
（5）充分混匀，然后置于0℃5 min，室温5 min，37℃2 h。
（6）最后加3 μl 500 mmol/l EDTA终止反应。
12. 取20 μl 在0.8%的琼脂糖上电泳。对照泳道应包括单链环状病毒DNA，双链闭环DNA和带切口的双链坏状DNA。
13. 根据电泳结 果估算DNA的量，用1~100 ng的双链DNA产物转化ung+大肠杆菌。
14. 选择性地或随机挑取所得克隆（噬斑或菌落）用以分离纯的克隆原种。
15. 通过DNA序列测定对选出的克隆进行分析。
13. 根据电泳结 果估算DNA的量，用1~100 ng的双链DNA产物转化ung+大肠杆菌。
14. 选择性地或随机挑取所得克隆（噬斑或菌落）用以分离纯的克隆原种。
15. 通过DNA序列测定对选出的克隆进行分析。
相关文章
