高容量载体中基因组DNA片段末端的分离(小载体PCR)

许多真核生物的基因所包含的 DNA，远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说，更是如此。因此，必须构建一套重叠的 DNA 克隆，这些克隆的 DNA 按次序排列能形成叠连序列（叠连群），可以涵盖一个很大的基因或目的区域。

T4 噬菌体 DNA 连接酶 限制性内切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ 耐热性 DNA 聚合酶 模板 DNA
扩增缓冲液 dNTP 溶液 乙醇 酚 氯仿 醋酸钠 T4 DNA 连接缓冲液
琼脂糖凝胶 核酸和寡核苷酸 寡核苷酸盒 带过滤层吸头 薄壁微量离心管 移液器 程控式 PCR 仪 水浴或冷却装置

一、材料

1. 缓冲液和溶液

10X 扩增缓冲液

dNTP 溶液（1 mmol/L，包括所有 4 种 dNTP ( pH 8.0；PCR 级)

乙醇

酚：氯仿（1:1, V/V）

醋酸钠（3 mol/L, pH 5.2）

10X T4 DNA 连接缓冲液

2. 酶及其缓冲液

T4 噬菌体 DNA 连接酶

限制性内切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ

耐热性 DNA 聚合酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

核酸和寡核苷酸

寡核苷酸盒 [ 5.0 OD260/ml (~8.5 μmol/L)]，用 TE ( pH 7.6) 溶解 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAGGGTTAGGTTCCTGC TACATCTCCAGCCT TGCA3'

寡核苷酸（接头）引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ], 用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAG3'

序列特异性寡核苷酸（载体) 引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ]。用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。

模板 DNA: 重组 BAC、YAC 或黏粒 DNA

4. 专用设备

自动移液器用的带过滤层吸头

扩增用的薄壁微量离心管（0.5 ml)

阳性对照专用的移液器

储存有扩增程序的程控式 PCR 仪

15℃ 水浴或冷却装置

二、方法

1. 用 PstⅠ或 NsiⅠ消化约 5 μg 模板 DNA。取一小份反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳，以确证所有的 DNA 都已经被酶解。

2. 用酚: 氯仿抽提混合液及标准的乙醇沉淀法回收 DNA，然后用 70% 的乙醇洗涤沉淀。将管子开口倒扣在一叠卫生纸巾上，使最后残留的乙醇挥发，然后用 50 μl H2O 溶解湿润的 DNA 沉淀。

3. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中，依次加入下列物质：10X T4 DNA 连接酶缓冲液 10 μl，消化后的 DNA 模板 20 μl，寡核苷酸盒子 5.0 OD260/ml 2 μl，T4 噬菌体 DNA 连接酶 5 Weiss 单位/μl 2 μl，加水至 100 μl。

设 3 个对照管，对照管的体系参照上述配方。其中一个无模板 DNA，另一个无寡核苷酸接头，第 3 个无 T4 DNA 连接酶。

4. 将实验管及对照管在 15℃ 下连接 12~16 h。

5. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中，依次加入下列物质：10X 扩增缓冲液 2 μl，1 mmol/L 4 种 dNTP 混合溶液（pH 7.0） 2 μl，接头的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl，载体的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl，取自步骤 4 的实验管 DNA 连接产物 1 μl，耐热 DNA 聚合酶 5.0 单位/μl 0.5 μl，加水至 20 μl。

设 3 个 PCR 对照。每只对照管中含有连接反应中相对应的对照反应液 1 μl。

6. 如果 PCR 仪没有高温顶壳，在反应混合体系里加一滴（约 50 μl）轻矿物油，以防止加热和冷却循环时样品的蒸发。另外，如果用热启动则加一滴石蜡。

7. 将 PCR 管放入 PCR 仪中，按下表输入程序后，开始扩增。



8. 将每一管扩增产物都取出一份（25%)，用琼脂糖凝胶电泳分析。